虫螨腈，又名溴虫腈（chlorfenapyr），是世界范围内常用的消灭棉铃虫和昆虫的新型农药^[1]。目前认为虫螨腈的杀虫机制是虫螨腈进入机体后，在多功能氧化酶的作用下，抑制线粒体中二磷酸腺苷（ADP）向三磷酸腺苷（ATP）转化，导致细胞能量供应中断^[2]，尤其对大脑、骨骼肌、心肌等代谢活跃的组织造成严重损害^[3-7]，但是影响线粒体能量转化的机制不明确，且无明确的动物中毒模型来观察虫螨腈中毒后脏器或组织的损害情况。虫螨腈在世界卫生组织毒性分类中分为Ⅱ类^[8]。此次研究通过对C57BL小鼠进行不同剂量的虫螨腈灌胃处理，根据各组小鼠中毒行为学症状、病死率、组织病理变化确定最合适的染毒剂量，并评估最小鼠主要脏器损害情况，为急性虫螨腈中毒研究提供相对稳定的动物模型建立方法。

1 材料与方法 1.1 实验动物

由斯贝福（苏州）生物技术有限公司提供的6~8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠80只体重（20±2）g，实验动物生产许可证SCXK(苏)2022-0006，所有实验动物均置于淮安市第一人民医院SPF级动物实验中心，21~25 ℃，昼夜各12 h，并在饲养3周后开始实验，实验前4 h禁食但不禁水，实验动物使用许可证号SYXK（苏）2018-0012，本实验符合3 R原则，并由淮安市第一人民医院动物实验中心伦理委员会审查批准。（批号：DW-P-2024-021-01）

1.2 主要试剂与仪器

MTP - 601F型荧光酶标仪(日本Corona公司), TJ - 6 Centrifuge型低温离心机(美国Beckman公司), UV - 1200型紫外-可见分光光度计(中国上海美谱达仪器有限公司), H - 7650型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)、虫螨腈原药（中国南京普诺恩生物技术有限公司，纯度为98.5%）、玉米油（中国南京普诺恩生物技术有限公司）、电子秤（瑞士梅特勒-托利多公司）、苯巴比妥注射液（中国上海上药新亚药业有限公司）。

1.3 虫螨腈溶液的配置

根据美国环境保护署发布的Chlorfenapyr Fact Sheet中雄性小鼠口服虫螨腈半数致死量（45.0 mg/kg）^[9]，将虫螨腈原药用无菌玉米油溶解分别配置为0.45、0.9、2.25、3.375、4.5 mg/mL。

1.4 小鼠急性虫螨腈中毒模型构建

采用随机数字表法将60只SPF级C57BL小鼠随机分为9.0、22.5、33.75、45 mg/kg 5个染毒剂量组（分别为0.1LD₅₀、0.2LD₅₀、0.5LD₅₀、0.75LD₅₀、1.0LD₅₀）及玉米油对照组，每组10只。通过一次性灌胃处理，记录染毒后各组小鼠的一般情况，对照组用10 mL/kg玉米油一次性灌胃处理。染毒7 d后予苯巴比妥腹腔注射麻醉后迅速取心、肝、肺、肾、大脑、骨骼肌浸泡于4%多聚甲醛中固定，常规脱水石蜡包埋、切片，进行组织病理学检查。根据中毒后一般情况与病理变化、病死率确定最佳染毒剂量。

1.5 小鼠急性虫螨腈中毒脏器损害评估

将SPF级C57BL小鼠随机分为1、3、7 d 3个时间组和对照组，每组5只，按选定的最佳剂量给予一次性灌胃染毒，分别在染毒后1、3、7 d予苯巴比妥腹腔注射麻醉后取血后处死。记录小鼠的一般情况，采用HE染色法观察心、肝、肺、肾、大脑、骨骼肌组织的病理变化。同时取上述组织电镜下观察各组织线粒体损害情况。另外对留取的血液标本进行肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活力、肌酐（Cr）的测定。

1.6 统计学方法

用SPSS 22.0软件进行分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组之间比较用方差分析（snk-q检验），以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 小鼠染毒后的一般情况

与玉米油对照组比较，4.5 mg/kg染毒组进食、饮水无明显减少，小鼠日常活动状态良好，体重较前增加，其余各染毒组小鼠前3 d内进食、饮水较对照组均有下降，其中33.75、45 mg/kg 2个染毒剂量组下降最为显著，且均出现不同程度的体重下降。第4天后9 mg/kg组进食、饮水增加，活动量增加。

2.2 各组小鼠生存率

对照组及4.5 mg/kg、9.0 mg/kg染毒剂量组在染毒后7 d全部存活，22.5 mg/kg染毒剂量组中2只在染毒第3天死亡，33.75 mg/kg染毒剂量组中2只小鼠于染毒第1天死亡，1只小鼠于染毒第3天死亡，45 mg/kg染毒剂量组中于染毒后第1天死亡3只，第2天死亡2只，第4天死亡1只，其余存活小鼠后续长期存活，见图 1。

2.3 小鼠血清中ALT、AST、CK、Cr、CK-MB测定

9 mg/kg染毒剂量组小鼠血清ALT、AST、CK、Cr、CK-MB检测结果显示，与正常组对比，染毒第1、3、7天ALT、AST、CK、Cr、CK-MB均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）见表1。

2.4 不同染毒剂量组小鼠第7天组织病理学观察

玉米油对照组小鼠心肌、大脑、骨骼肌、肝、肺及肾组织病理结构清晰，未见明显病理损害。4.5 mg/kg染毒组小鼠心肌细胞组织排列规则，间隙稍增宽，细胞无明显肿胀，细胞核无明显蜕变；小鼠大脑神经元细胞排列均匀，间隙稍增宽，部分神经元细胞稍水肿，细胞核无明显固缩及蜕变；小鼠骨骼肌细胞排列规则，界限清晰，部分细胞间间隙增宽，细胞核无明显蜕变；肝组织细胞排列规则，肝窦无明显增宽，界限清晰，细胞核清晰无固缩。肾组织细胞排列规则，肾小管无明显水肿及萎缩；肺组织细胞肺间隙无明显增宽，肺泡内无充血水肿。9 mg/kg、22.5 mg/kg染毒组小鼠心肌细胞排列不规则，部分细胞肿胀，细胞核蜕变；大脑组织神经元细胞密度下降，间隙明显增宽，细胞核蜕变；小鼠骨骼肌组织细胞萎缩，排列不规则，界限不清，细胞间间隙增宽，胞核蜕变；肝组织细胞肝窦增宽，细胞肿胀，界限不清，细胞核固缩。肾组织细胞界限不清，肾小管萎缩；肺组织细胞肺间隙增宽，间质血管扩张淤血，肺泡内出血，部分肺泡融合。33.75 mg/kg、45 mg/kg染毒组小鼠心肌细胞明显肿胀，排列不规则，界限不清，细胞核固缩明显；大脑组织神经元细胞间隙明显增宽，细胞肿胀，细胞核蜕变；小鼠骨骼肌组织细胞排列不规则，界限不清，细胞萎缩明显，细胞间间隙增宽，炎性细胞浸润，胞核蜕变、固缩；肝组织细胞肿胀坏死，界限不清，肝细胞点状坏死，炎性细胞浸润，细胞核固缩。肾组织细胞肿胀明显，界限不清，肾小管萎缩、坏死，色素沉着；肺组织肺泡萎缩，融合，肺泡壁扩张水肿，肺间隙增宽，间质血管扩张淤血，肺泡内出血明显。

2.5 9 mg/kg染毒剂量组小鼠第3天组织线粒体电镜观察

玉米油对照组小鼠心肌、大脑、骨骼肌、肝、肺及肾组织线粒体结构清晰，细胞基质致密，可见粗面内质网，线立体嵴结构完整，细胞基质中可见丰富核糖体，无明显病理损害。9 mg/kg染毒组小鼠心肌细胞线粒体电镜下观察可见心肌细胞水肿，肌节结构不清，明暗带结构模糊，线粒体肿胀，形态不规则，嵴部分断裂，分布较杂乱；大脑神经元细胞稍肿胀，细胞核不规则，轻度凹陷，核仁结构清晰，核周间隙正常，电镜下线粒体肿胀，大小均匀，膜完整，粗面内质网略显扩张，高尔基体囊泡肥大；骨骼肌电镜下可见胞质未见水肿，细胞器数量适中，肌原纤维部分断裂，粗细不一，肌丝结构稍松散，线粒体电镜下可见肿胀，核椭圆形，膜完整，基质部分溶解，嵴少许断裂，肌浆网稍扩张；电镜下肝细胞边界不清，细胞密度均匀，细胞器数量丰富，细胞核略显固缩，线粒体稍肿胀，膜完整，基质较多稀疏、空化，嵴部分锻炼，粗面内质网局部略显扩张，表面核糖体附着，脂滴数量较多，少量融合；肾脏组织电镜下可见肾小管上皮细胞膜边界不清，胞质无明显肿胀，细胞器丰富，细胞核近似椭圆形，核仁居边，间隙稍增宽，线粒体电镜下可见肿胀，膜完整，基质颗粒溶解，嵴部分断裂、紊乱，粗面内质网形态较短，略显扩张，质膜内褶数量略少，未见扩张，同时可见溶酶体及自噬溶酶体；肺组织电镜下可见肺泡Ⅱ型上皮细胞近似椭圆形，细胞膜局部模糊、破损，细胞器稍肿胀，细胞核呈不规则形，部分凹陷，染色质少量聚集，核仁边移，线粒体肿胀，部分膜破损，基质溶解，嵴部分断裂、短缩，粗面内质网扩张，板层小体肿胀，板层结构部分溶解、排空。见图 2。

2.6 9 mg/kg染毒组不同时间点组织病理变化

小鼠心肌组织细胞染毒第1天病理观察，心肌细胞肿胀，间隙增宽，第3天细胞排列不规则，心肌间质水肿、细胞肿胀、周围有炎性细胞浸润，第7天细胞水肿减轻，周围有炎性细胞浸润，细胞核蜕变固缩。染毒第1天，小鼠大脑组织病理观察可见神经元细胞肿胀，间隙增宽，神经元尼氏体减少，周围有炎性细胞浸润，第3天可见细胞排列不规则，神经细胞肿胀，炎性细胞浸润，细胞核蜕变，第7天神经细胞肿胀较前减退，间隙明显增宽，细胞核固缩蜕变。骨骼肌细胞在染毒第1天，骨骼肌细胞排列规则，细胞及间质肿胀，第3天，骨骼肌细胞肿胀加重，炎性细胞浸润，第7天骨骼肌细胞萎缩，细胞肿胀减轻，细胞界限不清，细胞间间隙增宽，胞核蜕变。肝组织染毒第1天病理观察可见肝细胞轻度肿胀，炎性细胞少量浸润，肝细胞点状样坏死，第3天肝细胞空泡样变，肿胀加重，炎性细胞浸润明显，第7天肝窦增宽，细胞肿胀，界限不清，细胞核固缩。肾组织在染毒第1天肾小管细胞出现肿胀，管腔不规则，第3天细胞肿胀加重，出现坏死样细胞，肾间质充血，炎性细胞浸润，第7天，细胞肿胀减轻，仍有少量炎性细胞浸润，界限不清，肾小管萎缩；肺组织染毒第1天病理观察可见肺泡间质血管充血水肿，间质增宽，第3天可见部分肺泡内出血，炎性细胞浸润，间质血管扩张淤血，第7天肺间质水肿减轻，炎性细胞浸润减轻，间质血管扩张淤血，部分肺泡融合。见图 2。

3 讨论

虫螨腈作为一种新型杀虫、杀螨剂，可通过皮肤、消化道、呼吸道、眼部等吸收，其中经消化道摄入为虫螨腈中毒患者最常见的摄入方式。美国环境保护署发布的Chlorfenapyr Fact Sheet中雄性小鼠急性口服虫螨腈半数致死量为45.0 mg/kg，雌性小鼠急性口服虫螨腈半数致死量为78.0 mg/kg，小鼠急性口服虫螨腈半数致死量为55.0 mg/kg^[9]，但是没有明确的动物实验报道。虫螨腈中毒病例逐渐增多，临床治疗难度大，病死率高。考虑到雄雌性小鼠的虫螨腈半数致死量不同，为了给药剂量的统一及造模的稳定性，本研究拟定选用雄性小鼠造模，设立4.5、9.0、22.5、33.75、45 mg/kg 5个染毒浓度梯度（分别为0.1LD₅₀、0.2LD₅₀、0.5LD₅₀、0.75LD₅₀、1.0LD₅₀）。该实验中4.5 mg/kg及9.0 mg/kg染毒组存活率均为100%，其中4.5 mg/kg染毒组小鼠中毒的症状不明显，中毒后进食、饮水无明显减少，体重甚至还有增加，且光镜下各脏器病理损害轻微。而9.0 mg/kg染毒剂量组小鼠中毒后进食、饮水减少，倦怠，第4天后开始缓解，进食、饮水增加，倦怠改善，且光镜及电镜下病理损害较明显，可作为虫螨腈经口中毒模型。22.5、33.75、45 mg/kg三组中高剂量染毒组进食、饮水明显减少，倦怠，但是在染毒第4天后，存活小鼠进食、饮水及活动量均有所改善，体重均有回升，结合笔者前期的预实验发现，急性中毒后小鼠死亡绝大部分均在中毒后3 d内死亡，存活率分别为80%、60%及40%。在预实验中对各染毒剂量组剩余存活小鼠连续观察30 d，未发现迟发性中毒症状，这与临床上观察到的中毒症状延迟不一致，考虑与人和小鼠不同种属的代谢酶的分型及活性（如细胞色素P450家族）的表达水平相关，因此在正式实验中选择连续观察7 d。

考虑到虫螨腈中毒机制为对线粒体能量代谢的影响，本次实验中主要观察中毒小鼠心、肝、肺、肾、大脑、骨骼肌等主要脏器组织的病理损害情况，发现染毒小鼠的主要脏器组织随着染毒剂量及染毒时间变化呈现出不同损伤改变。实验发现，4.5 mg/kg染毒组小鼠7 d后的心、肝、肺、肾、大脑、骨骼肌的病理损害不明显。9.0 mg/kg染毒剂量组各组织脏器均有不同程度损害，心、肝、大脑、骨骼肌损害更为明显。另外也在电镜下观察到9.0 mg/kg染毒小鼠不同组织的线粒体损伤情况，不同组织的线粒体均有不同程度的损害，而随着染毒剂量增大，相应器官组织的病理损害逐渐加重，可见虫螨腈中毒对小鼠各主要脏器均有不同程度的损害，但是结合目前诸多临床病例报道来看，急性虫螨腈中毒患者以神经系统、心肌损害为主，其他脏器损害相对少，具体机制尚不清楚，推测可能与肝脏、肾脏及肌肉组织对能量代谢失常耐受程度高有关。

通过染毒后小鼠的存活率、行为学表现及组织损伤程度，选择以9 mg/kg染毒组为中毒模型对小鼠各主要脏器损伤情况进一步观察，发现小鼠在染毒1~ 3 d心、肝、肺、肾、大脑、骨骼肌出现较为明显病理损伤，之后逐渐减轻，同时小鼠的ALT、AST、CK、Cr、CK-MB在染毒后第1天各指标较对照组明显升高，后逐渐降低，提示该染毒剂量的急性口服虫螨腈中毒小鼠模型组织病理检查结果与其中毒后行为学与体重变化相一致，说明通过一次性虫螨腈灌胃染毒诱导急性虫螨腈小鼠模型是可靠的。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  李潇风、谢守祥、孙虹：研究设计、实验操作、论文撰写；高素敏、陈亮：数据收集、统计学分析；张瑞瑞、毛征生：论文修改