2020, Vol. 29
2 天津市第一中心医院重症医学科、天津市急救医学研究所，300192
2 Department of critical care medicine, Tianjin First Center Hospital, Tianjin Institute of Emergency Medicine, Tianjin 300192, China
脓毒症是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍[1]。近些年随着医疗技术不断进步，护理措施日趋完善，越来越多的患者得以渡过脓毒症早期免疫亢进状态。但是部分幸存患者会进展至机制更加复杂的持续炎性反应-免疫抑制-分解代谢综合征（persistent inflammation-immunosuppression and catabolism syndrome，PICS）阶段，这类患者大多预后不良，这也是脓毒症患者病死率居高不下的主要原因[2]。早期识别PICS并给予及时治疗是改善脓毒症患者预后的重要手段，目前尚无特异性生物标志物用于PICS的早期识别。免疫麻痹（免疫抑制）是PICS的核心[3]。程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1，PD-1)是T细胞耗竭的特征性抑制性受体，可做为反映免疫抑制的标志物[4-5]。SIRT2是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+）依赖型去乙酰化酶，其参与脓毒症免疫、炎症及代谢反应调节，提示其表达量的变化与脓毒症的免疫反应调节相关[6-7]。本研究通过分析SIRT2在脓毒症患者进入PICS阶段过程中表达量的改变，并与PD-1比较，探讨SIRT2对PICS的早期预测价值。
1 资料与方法 1.1 一般资料纳入2018年6月到2019年6月在天津市第一中心医院重症监护病房（intensive care unit，ICU）的脓毒症患者81例。入组标准：年龄≥18岁；诊断符合sepsis3.0标准[1]，即存在感染，序贯性器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）评分≥2分。排除标准：年龄﹤18岁；有免疫性疾病或使用免疫抑制剂患者；确诊恶性肿瘤的患者；发生脓毒症前30 d内接受放疗或化疗患者；妊娠期患者。筛选出ICU住院时间超过14 d的患者，共计45例，男性33例，女性12例，所有患者年龄在26~95岁，年龄（69.1±16.6）岁。参照Mira等[8]诊断PICS的标准，即ICU住院天数14 d时，满足C反应蛋白﹥50 μg/dL；外周血淋巴细胞计数﹤0.8×109/L；血清白蛋白﹤30 g/L三项条件，则为PICS组，其余为非PICS组。募集20例健康成年志愿者做为对照组。
本研究符合医学伦理标准，并已通过医院伦理委员会审核（审批号：2018N085KY），且取得患者及家属的知情同意。
1.2 临床数据收集收集年龄、性别、感染部位、ICU住院天数、28 d病死率等信息，记录收住当天外周血淋巴细胞计数、C反应蛋白、血清白蛋白、SOFA评分，急性生理慢性健康（acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ）评分等指标。入院后患者接受脓毒症规范治疗。
1.3 指标检测患者入院0 h、24 h、4 d、7 d、10 d、14 d、17 d、21 d分别抽取外周静脉血5 mL（对照组于清晨空腹仅抽取1次），密度梯度离心法分离单个核细胞和上清液液后放置-80℃冰箱备用。
逆转录-聚合酶链反应检测单个核细胞SIRT2 mRNA和PD-1 mRNA。采用Trizol法提取细胞总RNA，并检测RNA的纯度和浓度，A260/A280值在1.8~2.0之间，再将1 μg RNA逆转录为cDNA，最后使用LightCycler 480扩增仪（试剂盒SYBR Premix Ex Taq购自日本TaKaRa公司）进行扩增反应，反应条件设定参照试剂盒说明书。以GAPDH为内参，每样本设平行反应孔3个，取平均Ct值计算2-△△Ct值，作为各样本mRNA的相对表达量。引物均由上海生工生物工程公司合成（具体序列见表 1）。
| 基因 | 引物序列 | |
| SIRT2 | 上游引物： | TGCGGAACTTATTCTCCCAGA |
| 下游引物： | GAGAGCGAAAGTCGGGGAT | |
| PD-1 | 上游引物： | CCAGGATGGTTCTTAGACTCCC |
| 下游引物： | TTTAGCACGAAGCTCTCCGAT | |
| GAPDH | 上游引物： | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT |
| 下游引物： | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG | |
酶联免疫吸附法检测上清液液肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor alpha, TNF-α）、白细胞介素6（Interleukin 6, IL-6）、白细胞介素10（Interleukin 10, IL-10）、转化生长因子β（Transforming growth factor beta, TGF-β）水平，试剂盒均购自天津倍瑞格生物科技有限公司，操作按照说明书进行。
1.4 统计学方法以SPSS 20.0软件进行数据统计分析，服从正态分布的计量资料均数±标准差(Mean±SD)表示，采用两独立样本t检验或单因素方差分析；非正态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）[M(QR)]，采用非参数秩和检验分析；计数资料以%表示，采用χ2检验分析；绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC curve），计算曲线下面积（area under the curve，AUC），评价SIRT2和PD-1对脓毒症进展为PICS的预测价值；以P﹤0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 基本情况纳入脓毒症病例45例，其中感染部位主要在呼吸系统27例，消化系统10例，泌尿系统4例，皮肤软组织2例，导管相关2例。3组性别比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。PICS组年龄大于非PICS组及对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。PICS组ICU住院天数大于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。非PICS组与PICS组28 d病死率，SOFA评分，APACHEⅡ评分、外周血淋巴细胞计数、C反应蛋白、血清白蛋白比较差异无统计学意义（P﹥0.05）。非PICS组与PICS组入院时SIRT2和PD-1表达均较对照组低，TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β水平均较对照组高，差异有统计学意义（P﹤0.05），且非PICS组PD-1表达低于PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）, 见表 2。
| 指标 | 对照组 | 非PICS组 | PICS组 | χ2/F/Z/t值 | P值 |
| 例数(例) | 20 | 21 | 24 | / | / |
| 男(例，%) | 12（60.0） | 16（66.7） | 17（70.8） | 1.306 | 0.520 |
| 年龄(岁，Mean±SD) | 68.6±17.2 | 61.1±19.5 | 76.2±9.3b | 5.224 | 0.008 |
| SOFA[分，(QR)] | / | 6(6.0) | 8(4.8) | -0.880 | 0.379 |
| APACHEⅡ[分，(QR)] | / | 15(7.5) | 17(6.8) | -1.551 | 0.121 |
| ICU住院天数(天，Mean±SD) | / | 17.6±3.0 | 21.3±6.0 | -2.587 | 0.013 |
| 28 d病死率(例，%) | / | 4（19.05） | 9（37.50） | 1.856 | 0.173 |
| 外周血淋巴细胞计数(×109/L，Mean±SD) | / | 1.21±0.99 | 0.54±0.59 | 1.486 | 0.147 |
| C反应蛋白(mg/L，Mean±SD) | / | 141.20±104.29 | 113.20±98.83 | 0.921 | 0.363 |
| 血清白蛋白(g/L，Mean±SD) | / | 35.4±6.99 | 33.7±5.08 | -0.932 | 0.358 |
| SIRT2 mRNA(Mean±SD) | 1.00±0.00 | 0.79±0.07a | 0.82±0.07a | 14.512 | 0.002 |
| PD-1 mRNA(Mean±SD) | 1.00±0.00 | 0.85±0.25a | 0.92±0.05ab | 11.871 | 0.003 |
| TNF-α(pg/mL，Mean±SD) | 16.9±2.31 | 114.8±25.11a | 112.1±31.5a | 45.155 | 0.000 |
| IL-6(pg/mL，Mean±SD) | 12.3±0.84 | 29.3±5.48a | 31.2±3.92a | 58.524 | 0.000 |
| IL-10(pg/mL，Mean±SD) | 24.5±2.90 | 46.6±9.57a | 47.3±11.85a | 16.507 | 0.000 |
| TGF-β(pg/mL，Mean±SD) | 20.5±2.10 | 25.9±2.38a | 24.6±4.15a | 6.636 | 0.006 |
| 注：与对照组比较，aP ﹤ 0.05；与非PICS组比较，bP ﹤ 0.05 | |||||
随时间推移，两组的SIRT2水平呈先降低后升高趋势，第10天开始PICS组SIRT2表达明显高于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）；前10 d两组PD-1表达变化不明显，第14天开始PICS组PD-1表达明显高于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。见表 3。
| 指标 | 非PICS组 | PICS组 | t值 | P值 |
| SIRT2 mRNA | ||||
| 0 h | 0.79±0.07 | 0.82±0.07 | -0.616 | 0.561 |
| 24 h | 0.74±0.09 | 0.74±0.05 | -0.082 | 0.938 |
| 4 d | 0.69±0.07 | 0.74±0.05 | -1.128 | 0.308 |
| 7 d | 0.78±0.03 | 0.70±0.07 | 2.028 | 0.113 |
| 10 d | 0.87±0.08 | 1.15±0.09 | -4.556 | 0.004 |
| 14 d | 0.88±0.08 | 1.33±0.12 | -6.492 | 0.001 |
| 17 d | 0.99±0.04 | 1.27±0.13 | -4.222 | 0.016 |
| 21 d | 1.01±0.08 | 1.18±0.11 | -2.581 | 0.046 |
| PD-1 mRNA | ||||
| 0 h | 0.85±0.05 | 0.92±0.05 | -1.858 | 0.113 |
| 24 h | 0.86±0.05 | 0.87±0.04 | -0.373 | 0.722 |
| 4 d | 0.86±0.05 | 0.91±0.06 | -1.167 | 0.288 |
| 7 d | 0.85±0.12 | 0.88±0.06 | -0.421 | 0.694 |
| 10 d | 0.86±0.05 | 0.85±0.02 | 0.547 | 0.615 |
| 14 d | 0.86±0.04 | 1.01±0.02 | -6.302 | 0.003 |
| 17 d | 0.95±0.07 | 1.12±0.09 | -2.769 | 0.033 |
| 21 d | 0.98±0.04 | 1.12±0.07 | -3.291 | 0.022 |
随时间推移，两组TNF-α水平均呈逐渐下降趋势，第21天时PICS组TNF-α水平高于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）；两组IL-6水平均呈逐渐下降趋势，第7天和21天时PICS组IL-6水平高于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）；两组IL-10水平呈先升高后降低趋势，第10天、14天及21天IL-10水平高于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）；两组TGF-β水平呈先升高后降低趋势，第14天、17天及21天时TGF-β水平高于非PICS组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。见表 4。
| 指标(pg/mL) | 非PICS组 | PICS组 | t值 | P值 |
| TNF-α | ||||
| 0 h | 114.8±25.11 | 112.1±31.5 | 0.189 | 0.853 |
| 24 h | 97.7±18.25 | 93.5±15.13 | 0.488 | 0.635 |
| 4 d | 78.1±13.81 | 75.6±14.42 | 0.346 | 0.735 |
| 7 d | 59.9±11.96 | 58.0±9.49 | 0.343 | 0.738 |
| 10 d | 42.9±6.52 | 41.4±12.35 | 0.293 | 0.775 |
| 14 d | 26.8±4.56 | 26.3±5.06 | 0.172 | 0.866 |
| 17 d | 30.8±8.86 | 28.3±6.50 | 0.628 | 0.543 |
| 21 d | 16.3±2.36 | 24.4±3.50 | -5.331 | 0.000 |
| IL-6 | ||||
| 0 h | 29.3±5.48 | 31.2±3.92 | -0.741 | 0.475 |
| 24 h | 27.9±3.39 | 31.1±3.36 | -1.834 | 0.090 |
| 4 d | 24.7±2.13 | 26.3±2.05 | -1.417 | 0.181 |
| 7 d | 21.0±2.80 | 23.9±1.15 | -2.606 | 0.032 |
| 10 d | 19.8±1.73 | 21.1±1.26 | -1.618 | 0.134 |
| 14 d | 16.2±1.52 | 16.8±2.05 | -0.683 | 0.507 |
| 17 d | 13.0±1.57 | 13.7±1.78 | -0.814 | 0.430 |
| 21 d | 11.8±0.68 | 13.7±2.00 | -2.399 | 0.032 |
| IL-10 | ||||
| 0 h | 46.6±9.57 | 47.3±11.85 | -0.125 | 0.902 |
| 24 h | 49.0±6.00 | 46.3±9.54 | 0.653 | 0.525 |
| 4 d | 42.8±6.41 | 41.6±6.24 | 0.371 | 0.717 |
| 7 d | 60.5±9.76 | 58.8±8.59 | 0.359 | 0.762 |
| 10 d | 38.2±5.45 | 54.8±10.65 | -3.697 | 0.003 |
| 14 d | 36.1±6.31 | 50.0±10.67 | -3.110 | 0.009 |
| 17 d | 32.3±4.00 | 41.8±10.94 | -2.153 | 0.051 |
| 21 d | 24.7±2.94 | 40.1±7.00 | -5.692 | 0.000 |
| TGF-β | ||||
| 0 h | 25.9±2.38 | 24.6±4.15 | 0.752 | 0.466 |
| 24 h | 26.4±3.89 | 27.6±6.85 | -0.392 | 0.702 |
| 4 d | 25.2±3.03 | 28.6±7.54 | -1.161 | 0.274 |
| 7 d | 25.6±2.56 | 25.2±3.47 | 0.266 | 0.795 |
| 10 d | 23.2±3.50 | 25.9±6.33 | -1.034 | 0.323 |
| 14 d | 30.1±2.82 | 40.8±3.78 | -6.309 | 0.000 |
| 17 d | 31.2±6.61 | 39.2±6.66 | -2.311 | 0.038 |
| 21 d | 20.1±2.82 | 36.7±3.57 | -10.067 | 0.000 |
PD-1的AUC为0.766（95%CI：0.624~0.908），截断值为1.01时，灵敏度70.8%，特异度81.0%；SIRT2的AUC为0.841（95%CI：0.722~0.960），截断值为1.10时，灵敏度79.2%，特异度81.0%。SIRT2的AUC、灵敏度均优于PD-1。见图 1。
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| 图 1 SIRT2、PD-1预测脓毒症进展为PICS的ROC曲线 Fig 1 ROC curve of SIRT2 and PD-1 predicting sepsis progression to PICS |
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随着抗感染、液体复苏、器官保护等综合治疗措施的实施，越来越多的患者得以成功脱离早期危重状态，但是脓毒症仍然是重症患者的主要死因[9]，原因在于部分幸存者进入以免疫抑制为主导的PICS阶段，该阶段患者由于免疫抑制易发生反复感染，导致持续炎症反应以及能量消耗而陷入营养衰竭，后者又进一步加剧病情，使患者住院时间延长及远期病死率明显增加[10]，给患者及家属造成沉重的精神压力和经济负担。严重感染导致巨噬细胞功能障碍、T淋巴细胞耗竭及抑制性细胞群(包括调节性T细胞和髓源性抑制细胞)增多均是免疫抑制的可能机制[11]，因此单用外周血淋巴细胞计数评估复杂的免疫系统不够全面。早期识别PICS是目前临床工作者面临的难题之一[3]。
SIRT2做为NAD+依赖型去乙酰化酶，主要定位于细胞质，但其可以在细胞质与核内来回穿梭，参与衰老、代谢、应激反应、炎症反应、肿瘤形成等生理或病理生理过程[12]。研究显示SIRT2是其家族在髓样细胞中表达量最高的蛋白，尤其是在巨噬细胞中[13]。目前，SIRT2在脓毒症免疫反应过程中的生物学功能尚不明确。Buechler等[14]研究显示SIRT2基因过表达的小鼠脓毒症模型中，小肠微血管内皮细胞E-选择素和细胞黏附分子-1含量下降，细胞间的黏附能力减弱，小鼠7 d存活率明显改善；Zhao等[15]在致死性脓毒性休克小鼠模型中，给予SIRT2抑制剂治疗后，脓毒症相关的“细胞因子风暴”减弱，小鼠存活率明显提高。由此可见SIRT2的表达量与脓毒症免疫反应及预后有关。
PD-1属于免疫球蛋白超家族的一员，广泛表达于免疫效应细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞[16]；严重感染时，PD-1与其配体相互作用，上调的PD-1负性调节T细胞功能，导致免疫应答障碍[17]。研究[18]报道促炎细胞因子浓度的改变可以反映免疫功能的改变，因为免疫抑制状态下单核细胞产生促炎细胞因子的能力受限，导致TNF-α等细胞因子分泌降低。因此通过动态观察脓毒症患者PD-1及细胞因子的变化来反映PICS免疫抑制状态。本研究显示脓毒症14 d时PICS组PD-1表达较非PICS组明显上调；两组促炎因子水平随时间推移均呈不同程度下降，14 d左右PICS组抗炎因子IL-10、TGF-β水平仍明显高于非PICS组，这符合脓毒症进展为PICS时低度炎症与免疫抑制并存的表现[8]。研究[19]表明在脓毒症肥胖小鼠模型中，检测到在低度炎症期间（免疫抑制阶段）SIRT2表达是上调的。本研究显示从脓毒症第10天开始，PICS组SIRT2表达同样明显上调，故我们推断免疫抑制阶段SIRT2表达上调。关于SIRT2调节免疫抑制的作用机制，Wang等[19]认为与高表达的SIRT2使核转录因子-κB（NF-κB）p65去乙酰化减少促炎因子释放有关；研究[20]通过体内及体外实验均显示SIRT2通过赖氨酸310处的p65去乙酰化以调控依赖NF-κB的相关基因表达，由此可见NF-κB p65的去乙酰化在SIRT2调节免疫抑制方面发挥重要作用。
本研究中SIRT2的AUC、灵敏度均优于PD-1，表明SIRT2在脓毒症进展为PICS中具有一定的预测价值，此外PICS组SIRT2表达上调早于PD-1，提示SIRT2预测脓毒症进展为PICS在时间上可能要早于PD-1。
本研究发现PICS组患者平均年龄明显高于非PICS组患者，主要是因为高龄患者本身脏器代偿功能减退，同时往往存在一种甚至几种基础疾病，在遭受感染等打击时更容易出现器官功能障碍，这类患者病情恢复缓慢，造成ICU滞留时间延长，并且预后也不容乐观。随着我国人口老龄化的到来，估计这样的患者会呈逐年递增趋势。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
| [1] | Singer M, Deutschman C S, Seymour C W, et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3)[J]. JAMA, 2016, 315(8): 801-810. DOI:10.1001/jama.2016.0287 |
| [2] | Kempker J A, Martin G S. The Changing Epidemiology and Definitions of Sepsis[J]. Clin Chest Med, 2016, 37(2): 165-179. DOI:10.1016/j.ccm.2016.01.002 |
| [3] | 丁仁彧, 马晓春. 持续炎性反应-免疫抑制-分解代谢综合征:一种特殊类型的慢重症[J]. 中华胃肠外科杂志, 2016, 19(7): 734-736. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0274.2016.07.003 |
| [4] | Patil N K, Guo Y, Luan L, et al. Targeting Immune Cell Checkpoints during Sepsis[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(11). DOI:10.3390/ijms18112413 |
| [5] | 贾育梅, 李春盛. 血糖对严重脓毒症合并2型糖尿病患者程序性死亡因子-1表达的影响[J]. 中华急诊医学杂志, 2017, 26(12): 1432-1437. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2017.12.020 |
| [6] | 李露兰, 陈仲清, 赵克森, 等. 去乙酰化酶sirtuins在脓毒症中的作用:有利还是有害?[J]. 中华危重病急救医学, 2019, 31(1): 23-28. DOI:10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2019.01.006 |
| [7] | Wang X, Buechler N L, Woodruff A G, et al. Sirtuins and Immuno-Metabolism of Sepsis[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(9). DOI:10.3390/ijms19092738 |
| [8] | Mira J C, Gentile L F, Mathias B J, et al. Sepsis Pathophysiology, Chronic Critical Illness, and Persistent Inflammation-Immunosuppression and Catabolism Syndrome[J]. Crit Care Med, 2017, 45(2): 253-262. DOI:10.1097/CCM.0000000000002074 |
| [9] | 陈振英, 何小军. 2018中国脓毒症研究发展蓝皮书及未来展望[J]. 中华急诊医学杂志, 2019, 28(10): 1332-1334. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2019.10.032 |
| [10] | Hawkins R B, Raymond S L, Stortz J A, et al. Chronic Critical Illness and the Persistent Inflammation, Immunosuppression, and Catabolism Syndrome[J]. Front Immunol, 2018, 9: 1511. DOI:10.3389/fimmu.2018.01511 |
| [11] | Hotchkiss R S, Moldawer L L, Opal S M, et al. Sepsis and septic shock[J]. Nat Rev Dis Primers, 2016, 2: 16045. DOI:10.1038/nrdp.2016.45 |
| [12] | Mendes K L, Lelis D F, Santos S. Nuclear sirtuins and inflammatory signaling pathways[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2017, 38: 98-105. DOI:10.1016/j.cytogfr.2017.11.001 |
| [13] | Zhang B, Ma Y, Xiang C. SIRT2 decreases atherosclerotic plaque formation in low-density lipoprotein receptor-deficient mice by modulating macrophage polarization[J]. Biomed Pharmacother, 2018, 97: 1238-1242. DOI:10.1016/j.biopha.2017.11.061 |
| [14] | Buechler N, Wang X, Yoza B K, et al. Sirtuin 2 Regulates Microvascular Inflammation during Sepsis[J]. J Immunol Res, 2017, 2017: 2648946. DOI:10.1155/2017/2648946 |
| [15] | Zhao T, Alam H B, Liu B, et al. Selective Inhibition of SIRT2 Improves Outcomes in a Lethal Septic Model[J]. Curr Mol Med, 2015, 15(7): 634-641. DOI:10.2174/156652401507150903185852 |
| [16] | Patera A C, Drewry A M, Chang K, et al. Frontline Science: Defects in immune function in patients with sepsis are associated with PD-1 or PD-L1 expression and can be restored by antibodies targeting PD-1 or PD-L1[J]. J Leukoc Biol, 2016, 100(6): 1239-1254. DOI:10.1189/jlb.4HI0616-255R |
| [17] | Zhang Y, Li J, Lou J, et al. Upregulation of programmed death-1 on T cells and programmed death ligand-1 on monocytes in septic shock patients[J]. Crit Care, 2011, 15(1). DOI:10.1186/cc10059 |
| [18] | 张俊谊, 杨毅, 刘玲. 程序性细胞死亡蛋白-1及其配体与脓毒症中T细胞耗竭状态[J]. 中华内科杂志, 2019, 58(2): 158-160. DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2019.02.016 |
| [19] | Wang X, Buechler N L, Martin A, et al. Sirtuin-2 Regulates Sepsis Inflammation in ob/ob Mice[J]. PLoS One, 2016, 11(8): e160431. DOI:10.1371/journal.pone.0160431 |
| [20] | Rothgiesser K M, Erener S, Waibel S, et al. Correction: SIRT2 regulates NF-kappaB-dependent gene expression through deacetylation of p65 Lys310[J]. J Cell Sci, 2019, 132(8). DOI:10.1242/jcs.232801 |