脓毒症是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的器官功能障碍^[1]，它启动了宿主促炎和抗炎过程的复杂相互作用^[2]。脓毒症的恢复程度取决于宿主协调促炎和抗炎反应的能力，以实现感染后的免疫稳态^[2-3]。脓毒症可以进展成脓毒性休克和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），而肠道被认为是MODS的起点^[4]。肠道是保障机体内环境稳态的先天性屏障，而免疫屏障是肠道屏障的重要组成部分。目前，脓毒症导致机体适应性免疫反应变化与肠道损伤的相关性研究较少，此外，在临床工作中，脓毒症患者难以获取肠道组织直接评估肠道免疫指标变化。因此，本研究通过监测脓毒症早期外周血T淋巴细胞亚群（适应性免疫细胞）和自然杀伤细胞（natural killer cells，NK细胞）（先天性免疫细胞）水平，探讨其与肠道血清学标志物，即肠型脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，I-FABP）和D-乳酸的相关性，及其对患者预后的影响，为脓毒症患者早期实施免疫治疗提供依据。

采用前瞻性的病例对照研究方法，以2018年9月至2019年5月宁夏医科大学总医院重症医学科（ICU）收治的61脓毒症患者（脓毒症组）为研究对象，选择同期17例普通术后非脓毒症患者作为研究对照（非脓毒症组）。

① 年龄≥18周岁；②符合Sepsis 3.0最新诊断标准^[5]；③入住ICU 24 h内诊断为脓毒症。

① 既往存在自身免疫性疾病；②妊娠和哺乳期女性；③长期使用糖皮质激素史；④入住ICU时间 < 24 h。同时，非脓毒症组患者和脓毒症组中选择拟检测肠道损伤标志物（血清I-FABP和D-乳酸）患者，附加排除标准：①既往存在慢性胃肠道疾病史；②既往存在慢性肾功能不全病史。

根据患者入住ICU是否发生脓毒症分为脓毒症组和非脓毒症组；根据随访28 d生存情况分为存活组和死亡组。

本研究获得患者或其直系亲属的知情同意，并且通过宁夏医科大学总医院科研伦理委员会批准（审批号：2018-295）。

收集脓毒症组和非脓毒症组入住ICU 24 h内的外周静脉血样本，测定T淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺）和NK细胞水平。同时，从脓毒症组中筛选既往无慢性胃肠道疾病和慢性肾功能不全的脓毒症患者35例，测定其和非脓毒症组血清I-FABP、D-乳酸水平。记录所有研究对象的年龄、性别、基础疾病。评估脓毒症组入ICU 24 h内急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ（APACHEⅡ），随访患者28 d生存情况。

所有研究对象入住ICU 24 h内采取静脉血，T淋巴细胞亚群和NK细胞水平使用美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪测定。血清D-乳酸水平（D-乳酸试剂盒由北京中生金域诊断技术股份有限公司生产）使用JY-DLT肠道屏障功能生化指标分析系统酶法检测；血清I-FABP水平（I-FABP试剂盒由武汉华美生物工程有限公司生产）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。

采用SPSS 25.0软件对数据进行处理和分析。所有数据均先进行正态性检验及方差齐性检验，以均数±标准差（Mean±SD）表示正态分布及方差齐的计量资料，采用独立样本t检验及方差分析；以中位数（四分位数）[M（Q_L, Q_U）]表示非正态分布的计量资料，采用秩和检验。计数资料比较采用χ²检验。采用Spearman相关法分析I-FABP、D-乳酸与T淋巴细胞亚群、NK细胞的相关性。采用二元多因素Logistic回归分析选择脓毒症患者28 d死亡的独立危险因素。以P < 0.05为差异有统计学意义。

本研究共纳入61例脓毒症患者及17例普通术后非脓毒症患者。两组间年龄和性别差异无统计学意义（均P > 0.05）；脓毒症组与非脓毒症组疾病构成比差异无统计学意义（P > 0.05），说明两组患者基线资料均衡可比，见表 1。

脓毒症早期外周血CD3⁺、CD4⁺、NK细胞水平较非脓毒症组均下降，并且两组差异具有统计学意义（均P < 0.05），CD8⁺水平在两组间差异无统计学意义（P > 0.05），见表 2。

从脓毒症组中筛选出既往无慢性胃肠道和慢性肾功能不全病史的脓毒症患者35例，发现脓毒症组血清I-FABP、D-乳酸水平均高于非脓毒症组，两组差异有统计学意义（P < 0.05），见表 3。

I-FABP与CD3⁺、CD8⁺呈负相关（均P < 0.05），但与CD4⁺、NK细胞之间无相关性（均P > 0.05）。D-乳酸与CD3⁺、CD4⁺呈负相关（均P < 0.05），与NK细胞呈正相关（P < 0.05），但与CD8⁺之间无相关性（P > 0.05），见表 4。

脓毒症患者存活组和死亡组比较，CD3⁺、CD8⁺、CD4⁺、NK细胞水平差异均无统计学意义（P > 0.05），见表 5。

如表 6所示，仅APACHEⅡ评分是脓毒症患者28 d死亡的独立危险因素（P < 0.01），早期CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、NK细胞水平与患者28 d预后无关(P > 0.05)。

先天性和适应性免疫应答的多种机制参与脓毒症的发病过程^[6-7]。先天和适应性免疫系统介导最初的致病菌清除和维持对后续暴露病原体的适当反应。感染期间释放的细菌和（或）细菌组分与免疫系统的不同类型细胞相互作用，并诱导其异常活化。既往研究表明，脓毒症早期的异常先天免疫反应导致终末器官损伤^[8-10]，然而适应性免疫与器官损伤的潜在关系研究匮乏。本研究旨在探讨脓毒症早期免疫反应变化（包括先天性免疫和适应性免疫）对肠道损伤和患者预后的影响。

T淋巴细胞计数和亚群分布在一定程度上反映了细胞免疫状态，CD3⁺是各种T淋巴细胞共同的表面标记物，表示T淋巴细胞的总数；CD4⁺是诱导/辅助T细胞（Ti/Th）的表面标记物，帮助B淋巴细胞产生抗体，诱导T淋巴细胞向效应细胞转化；CD8⁺是抑制T细胞（Ts）中的一种蛋白，介导宿主细胞被病原体感染后的破坏和溶解^[11]。NK细胞是公认的强效先天免疫细胞，在抗病毒和抗肿瘤免疫应答的产生中发挥重要作用。Tian等^[11]研究发现盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的脓毒症大鼠外周血T淋巴细胞亚群变化表现为CD3⁺，CD4⁺，CD4⁺/CD8⁺下降，并且下降趋势持续至36 h，但是，CD8⁺ T淋巴细胞无显著变化。Flohé等^[12]发现患者确诊脓毒症24 h后，外周血CD4⁺和CD8⁺水平均可明显减少。黄增峰等^[13]研究表明烫伤脓毒症大鼠外周血中NK细胞活性显著下降，且随时间延长加重。这些与本研究结果一致，表明脓毒症的早期即可发生免疫抑制，表现为外周血CD3⁺、CD4⁺、NK细胞水平下降，而CD8⁺水平无变化。此外，本研究发现外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞水平在脓毒症患者生存组和死亡组之间差异无统计学意义，并且均不是患者28 d死亡的危险因素。Hong等^[14]研究支持本研究结果。胡彩珍等^[15]发现影响患者住院期间死亡的危险因素为确诊脓毒症后第1天的CD4⁺/CD8⁺水平，CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺水平均非患者28 d死亡独立危险因素，这与本研究结果相符。目前研究认为，免疫功能受损的脓毒症患者通常呈现出全身性炎症反应综合征-代偿性抗炎反应综合征：持续性炎症-免疫抑制分解代谢综合征（persistent inflammation-immunosuppression catabolism syndrome，PICS）和MODS。脓毒症存活者最终成为PICS或MODS的长期受害者，即使在完全康复后，许多患者生活质量受损，长期病死率增加^[16]。长期免疫系统损伤被认为是脓毒症患者存活后延迟死亡的根本原因^[17]。以上说明，虽然脓毒症早期免疫抑制与患者28 d预后无关，但是脓毒症相关的免疫系统长期损害是存活患者死亡的潜在原因。

肠道屏障是一种复杂的多层结构，是抵挡病原体入侵机体的重要防线。I-FABP是一种仅存在于肠上皮细胞的胞质酶，其存在于血清中被认为是肠道上皮细胞损伤的标志^[18-19]。D-乳酸是人胃肠道中许多细菌产生的发酵产物，在健康个体血清中可以发现低水平的D-乳酸，当肠黏膜通透性受损时，D-乳酸水平因跨肠黏膜移位的增加而升高，故血清D-乳酸水平是肠道屏障功能受损的衡量指标^[20]。本研究结果发现脓毒症患者早期血清I-FABP、D-乳酸水平均高于非脓毒症组，说明脓毒症早期即发生肠道损伤。此外，有动物研究表明，严重脓毒症后的肠黏膜处于高度炎症状态，杯状细胞功能下降，黏膜重建受到影响，致肠道屏障损伤的修复能力障碍^[21]。可见，脓毒症对肠道黏膜损伤和修复均产生重要影响。

T淋巴细胞亚群和NK细胞分别与I-FABP、D-乳酸相关性分析显示，I-FABP与CD3⁺、CD8⁺呈负相关, D-乳酸与CD3⁺、CD4⁺呈负相关，但与NK细胞呈正相关。肠道黏膜表面由上皮细胞（epithelial cell，EC）排列，肠上皮主要由极化单层EC组成，其具有独特的屏障形成特征，在肠上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）的基底外侧有一组细胞称为上皮内淋巴细胞（主要由CD8⁺ T细胞组成），这些细胞与肠上皮细胞直接接触，并且紧邻肠腔中的抗原，上皮内淋巴细胞不仅感知肠道中的病原体，维持肠黏膜屏障的稳态，还可以促进免疫病理学和炎症性疾病^[22]。可见，CD8⁺与肠上皮细胞之间存在关联。本研究结果表明，CD8⁺水平与I-FABP呈负相关，证实此相关性。由于肠黏膜固有层中的大多数T淋巴细胞是CD4⁺ T淋巴细胞，CD8⁺T淋巴细胞的变化不是主要趋势^[23]，本研究发现CD4⁺与D-乳酸呈负相关，但是与I-FABP无相关性，说明肠道黏膜固有层免疫对维持肠黏膜通透性功能发挥重要作用。NK细胞在肠道中的功能比较复杂，肠道NK细胞不是集中的组织在淋巴聚集体中，而是分散在上皮细胞或基质中，除了微生物群的组分外，它们还与来自共生或病原微生物的大量抗原接触^[24]。此外，肠道中的NK细胞与几种细胞类型相互作用，包括上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树突细胞和T淋巴细胞，并有助于维持免疫稳态和有效免疫应答的发展。在肠道免疫系统中，NK细胞发挥双重作用，参与生理和致病过程^[24]。本研究发现NK细胞水平与D-乳酸呈正相关，提示在脓毒症早期，NK细胞可能参与肠黏膜通透性损伤过程。

综上所述，脓毒症早期即可发生免疫抑制和肠道损伤，并且免疫抑制程度和肠道损伤相关，但是与患者28 d预后无关。根据本研究结果推断，脓毒症早期给予增强免疫治疗，可能有助于改善肠道损伤，但仍需要后续临床实践证实。

本研究不足：虽然所有脓毒症组患者均在入住ICU 24 h内诊断为脓毒症，但是部分患者可能在入住ICU前病情已经发展为脓毒症而临床未早期发现诊断。其次，临床实践中难以获取脓毒症危重患者肠道组织样本，外周血与肠道组织T淋巴细胞亚群、NK细胞检测水平可能不一致，造成研究结果偏差。此外本研究为单中心研究，样本量相对较少，可能需要扩大样本量证实研究结果。

利益冲突   所有作者均声明不存在利益冲突