百草枯（paraquat, PQ）是广泛使用的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂，中毒后患者病死率极高，而肺广泛纤维化是PQ中毒患者死亡的主要原因^[1-2]。但是PQ中毒引起肺纤维化的机制仍未完全阐明。炎症小体是由识别分子（NLR、ALR等家族分子）、接头分子（凋亡相关点状蛋白ASC）、效应分子（caspase-1或caspase-11）组成的蛋白复合体，在病原微生物或环境因素等作用下激活，进一步活化caspase-1，促进IL-1β和IL-18的成熟释放，参与机体的免疫、炎性反应等过程^[3]。近年发现NLRP3炎性小体的异常激活参与调控组织器官纤维化的发生发展^[4-5]，PQ中毒后会导致NLRP3炎性小体的异常激活^[6]，但是PQ如何激活NLRP3炎性小体尚不清楚，本研究旨在探讨KCa3.1调控NLRP3炎症小体激活在百草枯致肺纤维化中的作用，为寻找PQ中毒的治疗靶点提供理论和实验依据。

PQ标准品（美国Sigma公司），胎牛血清（美国GIBCO公司），F-12K培养基（美国GIBCO公司），0.25%胰酶（杭州吉诺生物技术有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），NLRP3蛋白抗体（美国Santa Cruz公司），ASC蛋白抗体（美国Santa Cruz公司），Caspase-1抗体（美国Santa Cruz公司），KCa3.1蛋白抗体（美国Sigma公司），NIMA相关激酶7（never-inmitosis A related kinase 7，NEK7）蛋白抗体（美国Abcam），KCa3.1抑制剂TRAM-34（美国Sigma公司），钾离子化学比色法检测试剂盒（美国GenMed Scientifi cs公司），DAPI染色液（上海碧云天生物技术有限公司），ECL发光剂（美国Thermo公司）。

A549（肺泡上皮细胞）细胞购于美国ATCC公司。A549细胞培养在含10%FBS的F-12K培养基中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，隔天换液，待细胞长到80%~90%单层后，用0.25%胰酶消化，1:2传代培养。选取对数期细胞进行试验处理。

TRAM-34是KCa3.1的特异性抑制剂^[7]。细胞以1×10⁵/mL接种于六孔板中，置于培养箱中培养24 h，弃培养基，加入1 mL新鲜无血清培养基。细胞分为4组：对照组、TRAM-34组、PQ组及PQ+TRAM-34组。对照组：无特殊处理。TRAM-34组：加入TRAM-34（10 µmol/L）处理24 h。PQ组：根据课题组前期研究选择半数致死量的PQ浓度（800 µmol/L）作为干预浓度^[8]，800 µmol/L的PQ溶液处理细胞24 h。PQ+ TRAM-34组：TRAM-34预处理24 h后，800 µmol/L的PQ溶液处理细胞24 h。

浸泡玻片（无水乙醇），玻片置于多聚-L-赖氨酸中，37℃温箱15 min，PBS冲洗。将细胞以1×10⁵/每孔铺在玻片上，置于六孔板内，培养箱培养24 h。加入固定液固定10 min，PBS洗涤5 min×3次，封闭液封闭60 min。一抗孵育（KCa3.1浓度为1：100），4℃过夜。洗涤液洗涤5 min ×3次，荧光标记的二抗孵育60 min，洗涤液洗涤5 min × 3次。向载玻片上加入封片液（具有抗荧光淬灭作用），轻轻加盖玻片，避光移至荧光共聚焦显微镜下观察。

按照1.3实验方法处理细胞后，收集细胞中的蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。每个加样空加入12 µg样品，电泳，恒流（300 mA）转膜1 h，加入封闭液，封闭1 h，分别加一抗(其中NLRP3浓度为：1：1 000，ASC浓度为：1：800，Caspase-1浓度为：1：800，NEK7浓度为：1：1 000)。4℃摇床，过夜，洗膜，加入二抗，室温摇床2 h；洗膜，免疫荧光化学发光法（ECL）检测。

细胞钾离子浓度变化比色法定量检测试剂盒是利用四苯硼钠在碱性条件下与钾离子作用生成白色浑浊复合物，在分光光度仪下检测吸光峰值的变化而测定样品中总钾离子浓度。按照1.3实验方法处理细胞后，加入清理液轻轻洗涤细胞，加入胰酶消化，再次加入清理液，混匀，4℃ 300 g离心5 min，弃上清液，加入裂解液，震荡，4℃静置30 min，4℃ 16 000 g离心10 min，取上清液。按照说明书，加入反应液，分光光度仪测定OD值，计算样品钾浓度。

所有数据的分析采用SPSS 20.0统计软件，采用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异具有统计意义。

体外培养A549细胞，分为对照组与染毒组。免疫荧光下检测A549细胞中KCa3.1的表达，染毒组可见绿染的KCa3.1表达明显增加，见图 1。

DNA表达呈蓝色荧光，KCa3.1表达呈绿色荧光。对照组（A-C）见少量的KCa3.1形成。染毒组（D-F）经PQ刺激后，KCa3.1表达明显增到。（×400） 图 1 免疫荧光检测A549细胞中KCa3.1的变化 Fig 1 The expression of KCa3.1 in A549 cells by immun of luorescence

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构建PQ染毒肺泡上皮细胞（A549细胞）模型，同时给与KCa3.1抑制剂TRAM-34，观察细胞NLRP3炎症小体激活变化。结果显示，PQ处理后，A549细胞内NLRP3炎症小体明显激活，阻断KCa3.1后，NLRP3、ASC、Caspase-1表达明显减少（图 2），说明KCa3.1参与调控PQ中毒诱导的NLRP3炎症小体激活。

与CTL组比较，aP<0.05；与PQ组比较，bP<0.05 图 2 Western blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达变化 Fig 2 The expression of NLRP3, ASC, Caspase-1 detected by Western blot

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利用细胞钾离子化学比色法检测试剂盒检测细胞内钾离子变化。结果显示，PQ处理后细胞内钾离子明显下降，而抑制KCa3.1后细胞内钾离子下降明显减少（图 3），说明KCa3.1通道参与PQ诱导的细胞内钾离子外流。

与CTL组比较，aP<0.05；与PQ组比较，bP<0.05 图 3 A549细胞内钾离子变化 Fig 3 The level of potassium in A549 cell

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采用Western Blot检测NEK7的表达。结果显示，与对照组相比，PQ组中NEK7表达明显升高，抑制KCa3.1后NEK7表达明显下降（图 4），说明NEK7可能参与PQ中毒诱导的肺纤维化，并可能受KCa3.1调节。

与CTL组比较, aP<0.05;与PQ组比较, bP<0.05 图 4 Western blot检测NEK7蛋白表达变化 Fig 4 The expression of NEK7 detected by Western blot

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PQ是全球广泛使用的一种高毒类杂环除草剂，是发展中国家急性中毒患者死亡的主要原因。PQ中毒后，肺是其作用的主要靶器官，中毒后6 h内90%蓄积于肺内，迅速破坏肺的实质细胞，引起广泛的肺间质纤维化，患者死于急性呼吸衰竭^[9-10]。目前PQ中毒没有特异性解毒药物，治疗措施非常有限，患者病死率高达50% ~ 80%以上。前期工作中发现，在PQ中毒早期（2 h）大鼠肺组织中出现蓝染的胶原纤维，提示在中毒早期即有肺纤维化的启动^[11]。如何阻止PQ中毒后早期肺间质纤维化的发生，是降低PQ中毒患者病死率的关键，也成为困扰临床工作者的难题。

炎症小体是2002年被首次发现，现已成为炎症等领域的研究热点。当细胞受到信号刺激时，炎症小体可以被招募及激活，无活性capsase-1前体裂解成为有活性的capsase-1，且对IL-1β和IL-18前体加工，促进其成熟分泌至细胞外，参与炎症反应^[12-13]。近年来，炎症小体与肺部疾病的关系得到重视，而NLRP3炎症小体是以NLRP3蛋白作为模式识别受体的炎症小体，目前是研究较多、且与肺部疾病相关性较多的炎症小体。研究发现特发性肺纤维化患者肺泡灌洗液中，NLRP3、IL-1β、IL-6及capsase-1水平明显升高^[14]，抑制NLRP3炎症小体可减轻肺纤维化的程度^[14]。在不同原因（博来霉素、石棉等）诱导的肺纤维化模型中，肺组织及肺部巨噬细胞中有NLRP3炎症小体的激活^[15]。相关研究显示，NLRP3炎症小体的异常激活对百草枯引起的急性肺损伤至关重要^[6]。本研究也证实了百草枯染毒的肺泡上皮细胞内NLRP3炎症小体被激活。但是在PQ中毒后，NLRP3炎性小体如何激活尚不清楚。

NLRP3炎症小体的激活是一个受多因素、多途径调控的复杂过程。研究显示，经典的NLRP3炎症小体激活由两种信号共同作用，第一信号激活TLR4信号通路，促进核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活介导IL-1β等前体的产生，相当于物质储备阶段；第二信号则促进NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白复合体的组装活化caspase-1, 促进IL-1β等成熟释放^[16-17]。目前关于NLRP3炎症小体激活机制的研究集中在第二信号，主要包括细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高、溶酶体破裂和细胞内钾离子外流，而钾离子外流是这三个激活因子的共同途径^[18-19]，而其中K⁺外流即可由KCa3.1引发。KCa3.1广泛表达于哺乳动物的各个器官组织，由细胞内Ca2⁺激活，可促使K⁺外流，进而调节细胞膜电位和细胞内钙信号参与细胞分泌、周期调控、迁移和增殖等多种细胞活动^[20]。本研究发现，PQ中毒后，大鼠肺组织KCa3.1表达明显增加，给予KCa3.1特异性抑制剂TRAM-34后，纤维化程度明显减轻^[21]。文献报道提示：在单核细胞内抑制K Ca3.1的激活，阻止钾离子外流引起的NLRP3炎症小体的激活，减少炎症因子的释放^[22]。笔者推测，PQ中毒后NLRP3炎症小体的异常激活是否与KCa3.1有关。本研究发现，在PQ染毒的肺泡上皮细胞内抑制KCa3.1后，细胞内钾离子外流减少，NLRP3炎症小体激活下降。因此，PQ中毒后，可能存在K Ca3.1通道激活促进钾离子外流，进一步激活NLRP3炎症小体。

NIMA相关激酶7（never-in-m itosis A related kinase 7，NEK7）是一种具有调控细胞周期、促进细胞有丝分裂功能的丝氨酸/苏氨酸激酶。NEK7在人体多种组织如心、脑、肺、肝等广泛表达^[23]。Gabriel等^[24]研究发现，NEK7是细胞内钾离子外流激活NLRP3炎症小体的关键蛋白。LPS预处理的小鼠巨噬细胞，再给予ATP处理，可以明显增加NEK7和NLRP3相结合，进而促进NLRP3炎症小体复合体的组装和激活，而在NEK7基因敲除的小鼠巨噬细胞中，可明显抑制NLRP3炎症小体的激活，使caspase-1呈现低活化、IL-1β表达明显下降，进一步提示NEK7对NLRP3炎症小体的异常激活具有调控作用。本研究发现PQ染毒后，A549细胞中NEK7表达显著升高，给予TRAM-34抑制KCa3.1后，与PQ组相比，NEK7表达下降，提示：在PQ中毒中，可能存在KCa3.1激活促使细胞内钾离子外流，上调NEK7表达，进一步激活NLRP3炎症小体。

利益冲突   所有作者均声明不存在利益冲突