2020, Vol. 29
2 南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;
3 南昌大学第一附属医院肿瘤科, 南昌 330006;
4 南昌大学附属口腔医院检验科, 南昌 330006
2 Department of Critical Care Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanchang University;
3 Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University;
4 Department of Clinical Laboratory, Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
肾缺血-再灌注（ischemia reperfusion, IR）损伤是导致急性肾功能衰竭的主要原因之一，有着很高的发病率和致死率，目前临床尚缺乏有效的防治方法。活性氧激增、炎症介质过度释放、中性粒细胞大量浸润、细胞钙超载和线粒体功能障碍是导致肾组织损伤的关键因素[1-2]，这些病理过程涉及多层面的表达调控。虽然在蛋白编码基因调控方面的研究已经取得了很大进展，但依然不能全面理解肾IR的病理机制。近来研究表明，环状RNA（circRNA）在发育、肿瘤、心脑血管、神经损伤等多种疾病中发挥重要作用[3-6]，circRNA对发育和疾病的显著调节越来越受到关注，但其在肾脏IR损伤进展中表达谱的报道甚少。本研究利用小鼠肾缺血-再灌注损伤模型，通过高通量测序，分析circRNA在肾脏IR损伤后的表达模式及作用的主要信号途径，为进一步探讨肾IR损伤的病理机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂实验动物C57BL/6雄性小鼠(6~8周龄，体质量20~25 g)购自中国第二军医大学。血肌酐(SCR)和尿素氮(BUN)检测试剂盒采用Roche诊断产品有限公司产品（德国）；RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司（美国）；RNAClean XP Kit购自Beckman Coulter有限公司；RNase-Free DNase Set购自QIAGEN公司（德国）；逆转录试剂盒采用全式金产品（中国）；SYBR Green qPCR试剂盒购自Takara公司（日本）；蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司（中国）；YAP抗体（#14074）购自Cell Signaling Technology公司（美国）。
1.2 方法 1.2.1 肾缺血-再灌注损伤模型的制作及分组参考文献[7]制备小鼠IR损伤模型：以4%水合氯醛(10 μL/g)腹腔麻醉小鼠，双侧肾脏经腹中线切口显露，右肾蒂结扎后用无创微血管钳完全夹住左肾蒂，随即摘除右肾，用温热生理盐水润湿的纱布覆盖切口，左肾蒂夹闭45 min后松开血管夹，恢复肾脏血流灌注。假手术对照组采用上述相同的方法，不夹闭左肾蒂。缺血-再灌注组与假手术组每组3只造模成功的小鼠。再灌注24 h后处死小鼠。收集血液样本和左肾组织，待测。
1.2.2 血清生化指标及组织学检查采用罗氏生化免疫分析系统（Roche，德国）测定血肌酐(SCR)和尿素氮(BUN)浓度。以4%多聚甲醛固定肾组织标本石蜡包埋，苏木精、伊红染色，对肾小管损伤进行组织学分析。
1.2.3 总RNA的提取肾组织按每100 mg加入1 mLTrizol，冰上匀浆。随后按试剂说明书分离出总RNA。使用NanoDrop ND-2000分光光度计对RNA进行定性和定量分析，并使用Agilent生物分析仪2100检测RIN数，以检查RNA完整性。电泳质检合格后使用RNAClean XP Kit和RNase-Free DNase Set纯化总RNA。
1.2.4 文库构建和测序按照实验操作说明（VAHTS Total RNA-Seq Library PrepKit for Illumina，Vazyme）对纯化后的总RNA进行rRNA去除、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建。CircRNA测序由上海伯豪生物技术有限公司应用Illumina HiSeq 2500系统进行高通量双端测序。
1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）取1 μg样本总RNA，采用随机引物逆转录合成cDNA，以20 μL体系行qPCR扩增反应。引物序列见表 1，扩增反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。所有扩增反应均重复三次，并根据生成的熔解曲线检查扩增片段的特异性，所有实时定量数据分析采用比较CT方法(2-ΔΔCT)。
| Gene | primer sequence |
| circRNA.1100 | Forward 5’- ATGCTGGCATTGACACAGAC -3’ |
| Reverse 5’- CTCCTGGAACAGCAGGAAAG -3’ | |
| circRNA.1122 | Forward 5’- TATTTTTCAGGCCCCATCAG -3’ |
| Reverse 5’- CGTGTGTTGAGTCGCTTGAT -3’ | |
| Cpeb3 | Forward 5’- CTGTCTGTCACCTCCACAGT-3’ |
| Reverse 5’- ATCAGAGCAACGACAACACG-3’ | |
| β-actin | Forward 5’- CTGGAACGGTGAAGGTGACA -3’ |
| Reverse 5’- CGGCCACATTGTGAACTTTG -3’ |
按照蛋白提取试剂说明提取肾组织蛋白。采用WesTM全自动蛋白表达分析系统（美国ProteinSimple公司）检测各组蛋白水平。根据proteinsimple试剂盒说明书配制5XMasterMix（loading Buffer），ladder，样品，一抗和发光液。样品配制好后经95 ℃变性5 min，随后将配制好的试剂依次加入反应板内，以2 500 r/min离心5 min，上机。反应结束后检查荧光内参定位无误及ladder相对分子质量正确，经Compass软件分析结果，导出数据。
1.3 统计学方法计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示。应用GraphPad Prism 5进行统计学方法。两组间差异采用成组t检验，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠IR损伤模型的建立双肾缺血45 min后再灌注24 h，小鼠BUN（53.01±19.44）和SCR（198.8±19.12）水平较假手术组BUN（6.73±0.78）和SCR（29.07±6.67）显著升高（P＜0.05）（图 1B）。肾组织经苏木精-伊红(H & E)染色显示缺血肾组织肾小管上皮细胞破裂、充血，空泡形成、部分小管细胞刷状缘消失，管周毛细血管堵塞，与肾功能损害一致（图 1A）。结果表明肾缺血-再灌注模型成功建立。
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| A：肾组织HE染色。B：IR-24 h血尿素氮和肌酐水平。与假手术组比较，aP＜0.05 图 1 小鼠肾缺血-再灌注损伤24 h后肾组织病理及肾功能的改变 Fig 1 Functional and histological changes in the kidney ischemia-reperfusion injury of mice after 24 h |
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转录组测序共检测到肾组织circRNA 2 713个。两组间2倍以上显著表达变化的circRNA为21个（P＜0.05），其中10个circRNA上调，11个circRNA下调（表 2）；热图显示了差异表达的circRNA（图 2A）。为了进一步确认测序结果的可靠性，实验组随机选取circRNA.1100和circRNA.1122进行qRT-PCR验证。与假手术组比较，肾IR 1 d后circRNA.1100相对表达倍数为0.23±0.016，circRNA.1122为0.36±0.12，均显著降低（P＜0.05），与测序结果趋势一致（图 2B）。
| circRNA_id | locus | log2FC | Pvalue | updown |
| circRNA.1100 | 19:37044522|37068291(-) | -3.050586523 | 0.004862115 | DOWN |
| circRNA.1122 | 19:43798407|43799145(+) | # | 0.000661711 | DOWN |
| circRNA.1258 | 1:20209161|20239438(-) | # | 0.009669662 | DOWN |
| circRNA.1398 | 2:119434149|119445656(-) | Inf | 0.000893574 | UP |
| circRNA.1472 | 2:166048455|166051706(+) | Inf | 0.007010741 | UP |
| circRNA.1797 | 4:145154569|145156782(-) | -3.06681985 | 0.036929708 | DOWN |
| circRNA.1977 | 5:134621949|134627775(-) | Inf | 0.030806443 | UP |
| circRNA.1984 | 5:143090120|143090929(-) | # | 0.04012072 | DOWN |
| circRNA.2196 | 6:23107140|23122737(-) | -1.018642775 | 0.001576512 | DOWN |
| circRNA.2328 | 7:127484542|127486889(+) | # | 0.018423959 | DOWN |
| circRNA.237 | 11:77571607|77585494(-) | # | 0.020773305 | DOWN |
| circRNA.2600 | 9:32246447|32250787(+) | # | 0.023582481 | DOWN |
| circRNA.2618 | 9:48717283|48833099(-) | Inf | 0.011444736 | UP |
| circRNA.2623 | 9:52143675|52144426(-) | Inf | 0.021147654 | UP |
| circRNA.2651 | 9:64725502|64728429(-) | Inf | 0.003397568 | UP |
| circRNA.2689 | 9:7825615|7827009(-) | Inf | 0.010596714 | UP |
| circRNA.2746 | X:142752040|142834393(+) | # | 0.005637342 | DOWN |
| circRNA.384 | 12:77277361|77332329(+) | # | 0.047055465 | DOWN |
| circRNA.598 | 14:57733878|57734418(-) | Inf | 0.015514752 | UP |
| circRNA.618 | 14:74807474|74835775(-) | 2.703590692 | 0.029894071 | UP |
| circRNA.699 | 15:62107148|62107465(+) | Inf | 0.020281407 | UP |
| 注：#表示缺血-再灌注组未检测到明显表达，Inf表示假手术对照组未检测到明显表达 | ||||
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| A：列表示样本，行表示差异表达的circRNA，红色表示上调，绿色表示下调。B：与假手术组比较，aP＜0.05，#表示缺血-再灌注组未检测到明显表达。 图 2 缺血-再灌注组和对照组中circRNA的差异表达及qRT-PCR验证测序结果 Fig 2 Differentially expressed circRNAs between the control and IR groups and validation of randomLy selected differentially expressed circRNAs for RNA-seq by qRT-PCR |
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为探讨肾IR损伤后差异表达的circRNA可能参与的生物学功能，本研究对目标circRNA所注释的母基因进行GO（Gene Ontology) biological process和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）pathway富集分析。GO分析结果显示差异表达circRNA亲本基因显著富集在细胞周期、分裂、生长、凋亡、死亡及相关调控的生物过程中(图 3A)；KEGG通路注释基因分析显示前十位的通路中Hippo信号通路的富集系数（rich factor）最大，表明差异表达的基因在Hippo信号通路富集最显著（图 3B）。
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| A：GO富集分析（前10个生物过程），横轴表示p-value(-log10)。B：KEGG分析（前10个pathway） 图 3 差异表达的circRNA的功能分析结果 Fig 3 Functional annotation of differentially expressed circRNA |
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选择观察小鼠肾组织测序结果中表达丰度最高的circRNA.1100在IR损伤不同时间点的肾组织中的表达变化，肾IR 1 d后circRNA.1100转录水平相比于假手术对照组明显降低，肾IR 2 d和3 d持续显著下调，相对表达倍数分别为（0.24±0.08）和（0.34±0.03）（P＜0.05）（图 4A）；circRNA.1100母基因Cpeb3在肾IR 1 d、2 d及3 d的相对表达倍数分别为（0.047±0.022）、（0.098±0.027）和（0.185±0.055），与对照组比较，显著下调（P＜0.05）（图 4B）。
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| 与对照组比较，aP＜0.05 图 4 小鼠缺血-再灌注1 d、2 d、3 d后circRNA.1100和母基因Cpeb3的表达变化 Fig 4 Expression changes of circRNA.1100 and Cpeb3 in mice after 1 day, 2 days, and 3 days of ischemic reperfusion |
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采用westernblot检测分析Hippo效应分子YAP在肾IR不同时间点的表达情况，结果显示：相比于假手术组，肾IR 4 h后YAP蛋白表达增加，肾IR 2 d后显著升高，并持续高表达至肾IR第3 d（图 5），表明Hippo信号通路被抑制，磷酸化YAP蛋白的生物效应显著降低。
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| 与假手术组比较，aP＜0.05 图 5 小鼠缺血-再灌注4 h、1 d、2 d、3 d后YAP分子的表达变化 Fig 5 Expression changes of YAP in mice after ischemic re-perfusion 4 h, 1 d, 2 d and 3 d |
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circRNA是一类内源性的调控RNA分子，由前体mRNA(pre-mRNA)通过特殊的反向剪接形成。与线性RNA相比，circRNA具有稳定的共价闭环结构，没有游离的5 -帽子结构或3 -聚腺苷酸尾巴，通常不受RNA酶作用影响[8-9]。circRNA于1976年首次在类病毒中发现[10]，随着新一代测序技术的迅速发展，已在哺乳动物转录组中发现了数千种circRNA表达，且多数序列高度保守，具有组织细胞特异性以及发育时空特异性表达等特征[11-14]，参与了生长发育及多种疾病的发生发展，被认为是扮演重要调控作用的新的明星分子。约有1 664个circRNA在成体人肾组织表达，其中474个circRNA是肾组织特异表达[15]，显示了circRNA在肾组织细胞生物学过程中的潜在作用。
肾缺血-再灌注损伤是缺血缺氧肾组织恢复血流后再氧化而对肾组织造成的额外损伤。最近的多项研究揭示circRNA表达水平可被氧化应激等压力条件诱导，扮演维持体内平衡的重要角色，另一方面，circRNA也可能表达失常以适应应激反应而导致组织细胞损伤[16-18]。本研究显示肾缺血缺氧诱导circRNA表达发生显著改变，通过GO富集分析表明，显著差异表达的circRNA在肾IR损伤发生发展中的功能主要与细胞周期、分裂、生长、凋亡、死亡及相关调控的生物过程有关。肾小管上皮细胞等重要功能细胞凋亡和坏死是肾IR损伤的主要病理变化，提示circRNA可能在肾组织功能细胞的损伤修复中扮演关键角色。
本研究通过生物信息学分析显示Hippo通路可能是circRNA参与调控肾组织缺血和氧化应激的病理生理过程的主要信号通路。Hippo通路调节细胞增殖和凋亡，在维护组织稳态和损伤诱导的组织再生方面行使重要功能。Hippo通路由MST1/2和LATS1/2等一系列保守激酶组成，YAP为该通路下游的主要效应分子，Hippo通路通过级联磷酸化反应来负性调节YAP活性，当Hippo通路被抑制时YAP则可被转运至细胞核内与转录因子结合促进靶基因的表达，发挥促生长、抗凋亡等功能。YAP活性对于正常的组织生长发育及稳态维持不是必需的，但其对组织损伤后的组织再生却具有重要作用。实验组通过蛋白印迹实验进一步分析了肾IR后Hippo通路效应分子YAP的表达水平，结果显示肾IR损伤后4 h YAP蛋白表达明显增加，48~72 h显著上调，表明肾缺血-再灌注损伤抑制了Hippo通路激酶的活性，促使YAP水平上调，促进细胞的增殖和存活，Hippo通路可能是肾IR损伤后circRNA发挥调控组织再生修复作用的重要通路。
IR诱导的差异表达的circRNA中，课题组选择表达最为丰富的circRNA.1100，进一步通过48 h和72 h肾IR损伤模型观察其不同时间点的表达变化。结果显示继肾IR 24 h表达显著降低后，IR 48 h和72 h的肾组织中circRNA.1100表达持续显著下调。虽然circRNA.1100功能还不确定，但其母本基因Cpeb3，即胞质聚腺苷酸结合蛋白3，是一种调控mRNA翻译的RNA结合蛋白，参与有丝分裂、衰老和肿瘤发生，在细胞的增殖调控中发挥重要作用。实验组同步检测了IR后各时间点肾组织Cpeb3的基因转录情况，结果显示Cpeb3的表达也呈现明显下调趋势。以上数据表明circRNA.1100及其母基因参与了肾IR损伤的病理生理过程。现有研究表明circRNA调控细胞生物学过程的功能主要表现在作为海绵吸附miRNA行使ceRNA功能调控下游基因水平；与RNA结合蛋白相互作用，作为支架来调节蛋白功能；行使假基因功能调控靶基因表达；还可以以cis模式调控母基因的表达[19-22]。circRNA.1100是否作为ceRNA影响Hippo通路，或与母本蛋白结合亦或可能通过类似cis调控的机制影响母本基因水平从而调控肾肾IR过程中组织细胞的存活与凋亡，值得探讨。
本研究利用C57BL/6小鼠肾IR损伤模型建立差异显著的circRNA表达谱，初步分析了相关信号通路及差异表达显著的高丰度circRNA，实验结果有助于进一步理解肾缺血-再灌注损伤的机制，为探讨circRNA在肾IR损伤中的调控作用提供了实验基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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