2020, Vol. 29
糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是指发生于糖尿病（diabetes mellitus, DM）患者，但不能用其他原发性心脏病变来解释的心肌疾病，是糖尿病严重的并发症之一。该病在代谢紊乱及微血管病变的基础上引发心肌广泛灶性坏死纤维化，出现心功能异常，最终进展为心力衰竭、心律失常及心源性休克，重症患者甚至猝死。近年来关于自噬的研究成果已经展示了其对于糖尿病并发症的重要作用[1-4]。同时近年来研究发现糖尿病治疗宜降糖降脂与抗氧化并重，抗氧化治疗将打破氧化应激与糖代谢紊乱形成的恶性循环，成为糖尿病治疗的新策略[5-6]。齐墩果酸（oleanolic acid, OA）具有降糖降脂、抗氧化、调血脂和抗动脉粥样硬化等作用，其抗氧化能力强。本研究旨在探讨OA对DM大鼠心功能的影响及其作用机制，从而为临床防治DM提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 动物的选择与分组选择SPF级4周龄雄性SD大鼠50只，由苏州大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（苏）2012-0045。采用随机数字表法将大鼠分为：正常对照组（CON）、糖尿病组（DM）、糖尿病+齐墩果酸组（DM+OA）、糖尿病+氯喹（chloroquine，CQ）组（DM+CQ）和糖尿病+齐墩果酸+氯喹组（DM+OA+CQ），每组10只。
1.2 糖尿病模型的制备普通饲料适应性饲养1周后，开始喂食高脂高糖食物（质量百分比35.5%；购于Bioserv公司），4周后对空腹6 h的大鼠一次性腹腔注射链脲霉素（streptozotocin，STZ，购于Sigma）50 mg/kg（使用前溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液）。72 h后取尾静脉血检测血糖，大鼠血糖值≥16.7 mmol/L视为建立糖尿病模型成功[7]。每周检测体质量，每2周监测血糖。齐墩果酸（Oleanolic acid，OA，购于Sigma公司）80 mg/（kg·d）灌胃给药4周。氯喹10 mg/（kg·d）（Chloroquine，CQ，购于Sigma公司）腹腔注射4周。本研究中关于动物的处置和操作符合动物实验福利与伦理的基本要求。
1.3 经胸壁超声心脏功能检测应用超声心动仪（GE公司，VIVID7型号）及13 MHz高频线控探头（GE公司），检测心脏功能。M型超声心动图取样线在腱索水平测室腔的大小和室壁的厚度，主动脉根部内径和左房的大小，以及舒张期二尖瓣血流频谱。上述均按照美国超声医学标准进行，连续储存获得上述的超声图像，然后再用实时、慢速回放及冻结图像等技术对图像进行分析处理。各测量数据均取3~5个心动周期的均值。
1.4 测定LC3、p62、LAMP2、p-Ulk1、p-p70s6k及p-raptor蛋白表达DM大鼠模型建立后开胸取出心脏，剪刀剪碎标本，加入裂解液（P0013C），使用BCA蛋白浓度测定法测定待测样本蛋白含量，取蛋白50 μg，煮沸5 min，Western blot蛋白电泳分离蛋白，转膜后5%脱脂牛奶封闭2 h后，分别加入相对应的一抗4 ℃冰箱孵育过夜。第2天使用TBS-T漂洗后加入兔源二抗后摇床36 ℃孵育2 h，漂洗，最后使用化学发光分析法，以目的条带与内参GAPDH吸光度间的比值反映蛋白相对含量。
1.5 统计学方法使用SPSS 20.0软件系统分析数据，采用GraphPad Prism 5软件处理数据，正态分布计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠基本特征的比较与CON组比较，DM组大鼠体质量、心脏质量及血糖水平明显升高，血清胰岛素水平明显下降（P < 0.05）；与DM组比较，DM+OA组大鼠体质量、心脏质量及血糖水平明显降低，血清胰岛素升高（P < 0.05）；与DM+OA组比较，DM+OA+CQ组大鼠体质量及血糖水平降低，血清胰岛素水平明显升高（P < 0.05），而两组大鼠心脏质量差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
| 组别 | 体质量（g） | 心脏质量（g） | 体质量心脏质量比 | 血清胰岛素（pg/mL） | 血糖（mg/dl） |
| CON | 625.31±12.72 | 1.24±0.71 | 504.11±3.42 | 424.53±11.45 | 104.01±7.02 |
| DM | 775.33±16.54a | 1.62±1.14a | 520.36±6.26 | 239.32±9.54a | 337.89±14.59a |
| DM+OA | 647.32±16.27b | 1.34±0.79b | 545.82±6.09 | 383.47±11.41b | 111.49±15.44b |
| DM+CQ | 759.72±17.39 | 1.64±0.85 | 520.66±7.17 | 240.20±9.72 | 339.85±14.27 |
| DM+OA+CQ | 711.41±14.07c | 1.59±0.91 | 511.25±4.51 | 327.59±10.18c | 172.00±9.14c |
| 注：CON为对照组，DM为糖尿病组，DM+OA为糖尿病+齐墩果酸组，DM+CQ为糖尿病+氯喹组，DM+OA+CQ为糖尿病+齐墩果酸+氯喹组；与CON组比较，aP < 0.05；与DM组比较，bP < 0.05；与DM+OA组比较，cP < 0.05 | |||||
与CON组比较，DM组大鼠在心脏舒张末期前壁厚度减小、左室收缩末期容积和左室舒张末期容积下降（P < 0.05）；与DM组比较，DM+OA组大鼠心脏舒张末期前壁厚度增加、左室收缩末期容积和左室舒张末期容积升高（P < 0.05）；与DM+OA组比较，DM+OA+CQ组大鼠心脏舒张末期前壁厚度减小、左室收缩末期容积和左室舒张末期容积下降（P < 0.05）。而各组在心率、心脏收缩末期前壁、心脏舒张末期后壁、心脏收缩末期后壁和射血分数的差异无统计学意义（均P>0.05）。见表 2。
| 组别 | 心率（次/min） | 舒张末期心肌前壁厚度（mm） | 收缩末期心肌前壁厚度（mm） | 舒张末期心肌后壁厚度（mm） | 收缩末期心肌后壁厚度（mm） | 左室舒张末期容积（µL） | 左室收缩末期容积（µL） | 射血分数（%） |
| CON | 354±14 | 8.37±0.11 | 5.59±0.06 | 1.80±0.13 | 1.94±0.15 | 458.3±16.4 | 166.6±12.8 | 72±6 |
| DM | 357±16 | 7.58±0.25a | 4.89±0.14 | 1.64±0.22 | 1.73±0.16 | 376.6±13.6a | 132.6±10.8a | 67±6 |
| DM+OA | 378±17 | 8.63±0.14b | 5.26±0.21 | 1.53±0.14 | 1.57±0.19 | 473.6±18.6b | 174.6±12.7b | 70±4 |
| DM+CQ | 361±15 | 7.67±0.19 | 4.91±0.17 | 1.57±0.18 | 1.69±0.19 | 385.0±14.6 | 142.6±11.7 | 69±4 |
| DM+OA+CQ | 342±15 | 7.97±0.17c | 5.03±0.19 | 1.72±0.21 | 1.81±0.22 | 393.6±15.6c | 147.6±10.2c | 66±6 |
| 注：CON为对照组，DM为糖尿病组，DM+OA为糖尿病+齐墩果酸组，DM+CQ为糖尿病+氯喹组，DM+OA+CQ为糖尿病+齐墩果酸+氯喹组；与CON组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05；与DM+OA组比较，cP<0.05 | ||||||||
与CON组比较，DM组大鼠LAMP2、p-p70S6K及p-raptor蛋白表达明显降低（P < 0.05），而p-ULK1蛋白表达明显升高（P < 0.05）（图 1）。经OA治疗后的DM大鼠心肌自噬溶酶体相关标志蛋白LC3-Ⅱ与DM组比较表达明显升高（P < 0.05），p62蛋白表达降低（P < 0.05）。与DM+CQ组比较，DM+OA+CQ组p62蛋白表达降低（P < 0.05），LC3-Ⅱ蛋白表达升高（P < 0.05）。各组之间LAMP2蛋白表达差异无统计学意义（图 2）。
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| CON组为对照组，DM为糖尿病组；与CON组比较，aP < <0.05 图 1 CON组与DM组LAMP2、p-p70S6K、p-ULK1、p-raptor蛋白相对表达 Fig 1 The protein expression of LAMP2, p-p70S6K, p-ULK1 and p-raptor in the CON and DM groups |
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| CON为对照组，DM为糖尿病组，DM+OA为糖尿病+齐墩果酸组，DM+CQ为糖尿病+氯喹组，DM+OA+CQ为糖尿病+齐墩果酸+氯喹组；与DM组比较，aP < 0.05；与CQ+DM组比较，bP < 0.05 图 2 四组大鼠心肌自噬溶酶体相关标志蛋白LC3-Ⅱ、p62及LAMP2蛋白表达的比较 Fig 2 Comparison of protein expression of lc3-Ⅱ, P62 and LAMP2 in cardiac autophagososome-related markers in rats of the four groups |
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糖尿病心肌病发病机制十分复杂，但目前多项研究发现其与心肌细胞自噬活性具有相关性[8-10]。本研究通过观察DM大鼠给予OA和自噬通路特异性抑制剂CQ后，其心肌细胞中自噬相关蛋白（LAMP2、p-p70S6K、p-ULK1、p-raptor、LC3-Ⅱ、p62）的改变，以及结合超声心动图的变化情况，探讨OA对DM的保护作用及其机制。
OA具有潜在的抗炎、抗高血脂、抗高血糖、抗氧化等药理特性，在糖尿病治疗中既起到降糖降脂作用，又兼顾抗氧化治疗，为糖尿病心肌病治疗提供了新的选择。既往研究认为OA可以降低Ⅰ型糖尿病鼠血糖水平，还可以恢复损害的糖原水平，并降低肌肉和肝脏组织的糖原合酶活性使其接近正常状态[11-12]。另有研究发现，OA可以减少细胞的氧化损伤，改善内皮细胞功能，改善胰岛素抵抗[13-14]。自噬过程是一个连续过程，因此被形象地称为自噬流，自噬流是自噬小体形成和最终的消化过程，即自噬小体与细胞质内的初级溶酶体相接触，两者结合形成自噬溶酶体，并将存在于自噬小体内的物质消化降解的过程。LC3 Ⅱ和p62作为自噬小体的底物会在溶酶体中部分降解，目前已有研究证实，LC3 Ⅱ/Ⅰ升高启动自噬，p62被代谢表达下降[15-16]。本实验结果表明，DM大鼠较CON组大鼠体质量、心脏质量及血糖水平均明显升高，血清胰岛素水平下降（P < 0.05），超声心动图所反映的心脏功能明显减退；给予OA后，DM大鼠的体质量、心脏质量、血糖水平明显改善，心脏功能障碍减轻，心肌细胞中p62表达下降，与之伴随的是LC3 Ⅱ/Ⅰ表达升高。p62表达下降提示OA治疗后的DM大鼠心肌细胞自噬活性增强，表现出DM心肌保护作用。为探索OA对DM的保护作用是否直接通过调节自噬通路来实现，本研究进一步使用自噬通路的特异性抑制剂CQ，来观察OA对DM是否还具有保护作用，发现DM大鼠心肌细胞中p62表达升高，LC3Ⅱ/Ⅰ表达下降，超声心动图的心脏功能指标较DM大鼠心脏功能改善不明显。由此证实OA通过自噬通路调节相关蛋白（p-p70S6K、p-ULK1、p-raptor、LC3-Ⅱ、p62）实现对DM大鼠的心肌保护作用。然而自噬相关蛋白LAMP2在各组的变化差异无统计学意义，尚未得到合理解释，有待进一步实验分析。
综上所述，OA对糖尿病大鼠的心肌具有保护作用，其机制可能与增强自噬有关。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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