急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的致病因素众多^[1]，其临床诊断更多依赖客观辅助指标如氧合指数及胸片等，但由于机体存在代偿机制，上述指标异常时往往已错过最佳干预时机，因此特异性生物标志物是早期诊断ARDS的关键^[2]。ARDS的生物标志物可来源于中性粒细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和凝血与抗纤溶系统等，目前已有二十多种潜在诊断ARDS的生物标志物^[3]。因此近年研究认为组合生物标志物优于单项指标，能提高诊断的精准度^[4]。如何选择规律相同的生物标志物来避免重复是目前组合方案需解决的难题^[5]。

在众多生物标志物中，本研究选择四种不同细胞来源的生物标志物，包括肺表面活性蛋白B（surfactant proteins B，SP-B）、纤溶酶原活化抑制因子（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box B1, HMGB1）和可溶性晚期糖基化终产物受体（soluble receptor for advanced glycation end products，sRAGE），利用肺内吸入脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）建立ARDS动物模型，分析上述标志物在大鼠血清及支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中表达变化特点，为组合生物标志物检测的选择提供参考。

本实验在中山大学心肺脑复苏研究所完成，动物购置广州中医药大学动物实验中心，实验动物使用许可证[SYXK（粤）2012-0081]，本研究全程遵循动物实验伦理和福利原则。

(1)分组及时间点。36只健康SD级雄性大鼠，体质量（250±25）g，随机（随机数字法）分成LPS组和对照组，每组18只，选择建模后6、12、24 h为观察点，每个时间点各6只。

(2)建模方式。采用3%异戊巴比妥溶液（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后固定四肢及头部，钝性分离颈部皮下组织，暴露气管，行气管插管，其中LPS组按10 μg/mL将LPS（Sigma公司，美国）经气道注入，对照组注入等量无菌生理盐水。注入后将大鼠半仰卧位固定，左右摇晃促进溶液均匀分布，缝合伤口。观察时点采集组织样本行苏木精-伊红（HE）染色和动脉血氧分压（partial pressure of arterial oxygen，PaO₂）分析作为判断建模成功的标准。

(3)标本采集方式。在建模后6、12、24 h三个时间点留取标本。①血清标本：静脉采血针从下腔静脉穿刺采集静脉血，离心10 min后提取上清液，置于-80 ℃冰箱待测；②肺泡灌洗液：经气管插管向肺部注入3 mL无菌生理盐水，停留30 s左右，轻轻按摩肺组织并回抽灌洗液，再吸取新的生理盐水进行冲洗，肺泡灌洗液保证回收率 > 70%，重复操作2次；肺泡灌洗液离心10 min后提取上清液储存于-20 ℃冰箱备用。③肺组织：大鼠右中段肺叶用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗后于甲醇中固定。大鼠采样后处死。

① 动脉血气分析：抽取大鼠腹动脉血，用血气分析仪（雅培3000，美国）进行血气分析，测定PaO₂；②HE染色：右肺中叶经4%甲醛溶液固定后石蜡包埋切片，切片翻入60 ℃烤箱中熔蜡60 min；用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10 min，梯度酒精脱水各3 min；蒸馏水冲洗3 min；苏木精染色5 min后蒸馏水冲洗2 min；盐酸及氨水中分色各2~3 s，冲洗后入蒸馏水片刻；用70%酒精，90%酒精脱水各10 min，酒精伊红染色液染色3 min；纯酒精脱水3 min，使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ使切片透明；滴上中性树胶后封片。染色后在普通光学显微镜下采集病理图像。

血清及肺泡灌洗液采用酶联免疫吸附法检测试剂盒（MyBioSource公司，中国），遵循说明书进行操作，用ELx800酶标仪（BioTek公司，美国）进行分光度测定，SP-B、PAI-I、HMGB1、sRAGE标准曲线系数R²分别为0.95、0.98、0.96和0.97。

大鼠肺组织石蜡块切片后置于载玻片并放入温箱中烘干，依次放入二甲苯和梯度酒精脱蜡；擦干后加一抗，即sRAGE抗体（abcam公司，美国），PAI抗体和HMGB1抗体（CST公司，美国）和SP-B抗体（SANTA公司，韩国），于4 ℃冰箱中保存过夜；PBS洗3次后加入二抗（万桥生物公司，中国）温育0.5 h；PBS冲洗3次后擦干加入链霉亲和素-生物素复合物温育0.5 h；PBS冲洗3次擦干加入显色剂；冲洗复染后依次将载玻片放入梯度酒精和二甲苯中，封片晾干进行显微镜观察。

100 mg大鼠右肺组织添加1 mL RIPA裂解液和10 μL 100 mmol/L苯甲基磺酰氟后用FastPrep-24匀浆机（Millipore公司，美国）在冰上匀浆30 min，组织匀浆经4 ℃和12 000 g/min高速离心30 min后转移上清液，取60 μL的上清液加60 μL 2×电泳上样缓冲液进行沸水浴5 min，用12 000 g/min离心3 min去除不溶性蛋白。采用BCA试剂盒（Thermo公司，美国）对裂解液进行蛋白定量，根据结果上样蛋白电泳并用PVDF膜（Millipore公司，美国）转膜，5%牛血清白蛋白室温封闭膜2 h后加入兔一抗（Abcam公司，美国）4 ℃过夜，次日用Tris-HCl吐温缓冲盐溶液洗膜3次后羊抗兔二抗温育1 h，Tris-HCl吐温缓冲盐溶液再次洗膜3次加入ECL化学发光试剂（北京普利来基因有限公司，中国）后进行显影。

采用Image Pro Plus和Image J对图片进行分析。采用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（Mean±SD）表示，两组间比较采用成组t检验，各个时间点的比较采用重复测量的方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

如表 1所示，LPS组大鼠肺内注射LPS后动脉的PaO₂（mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）随着时间进行性降低，且与对照组比较差异有统计学意义（80.38±1.74 vs 84.17±1.96；72.20±1.70 vs 81.26±1.57；68.52±2.45 vs 81.45±1.51，均P < 0.05）。图 1中HE染色提示LPS可诱导大鼠出现弥漫性急性肺损伤改变，且随时间进一步恶化。

图 1 LPS组与对照组大鼠肺组织HE染色结果（×200） Fig 1 Comparison of the HE results of rats lung tissue between the LPS and control groups (×200)

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LPS组血清中HMGB1、SP-B和PAI-1进行性升高，且与对照组比较差异有统计学意义（均P < 0.05），但sRAGE与对照组相比，呈进行性下降（P < 0.05），仅24 h与其他时点的差异有统计学意义（P < 0.05）。

LPS组肺泡灌洗液中HMGB1、PAI-1和SP-B进行性升高，而sRAGE进行性下降，且与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），见表 2和表 3。

A、B分别为SP-B在血清和BALF中的变化；C、D分别为PAI-1在血清和BALF中的变化；E、F分别为HMGB1在血清和BALF中的变化；G、H分别为sRAGE在血清和BALF中的变化 图 2 大鼠血清和肺泡灌洗液中四种生物标志物变化趋势 Fig 2 The tendency graph of four biomarkers in serum and BALF of ARDS rats

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肺组织免疫组化结果见表 4和图 3。SP-B、PAI-1和HMGB1灰度值随着LPS处理时间延长而逐渐升高，SP-B、PAI-1和HMGB1的24 h或12 h与6 h的差异有统计学意义（P < 0.05）；相反的，sRAGE灰度值呈下降趋势，仅24 h与6 h的差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组化分析提示6 h起PAI-1在肺间质逐步上调表达，而HMGB1和SP-B则呈现肺泡内向肺实质扩散表达的趋势，但sRAGE则随时间呈下调表达趋势。

A、E、I和M为对照组，B、F、J和N为LPS处理6 h组，C、G、K和O为LPS处理12 h组，D、H、L和P为LPS处理24 h组 图 3 四项生物标志物免疫组化染色结果（×200） Fig 3 Immunohistochemical staining graphs of four biomarkers(×200)

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四项生物标志物肺组织Western blot分析显示，LPS组与对照组比较，SP-B、PAI-1和HMGB1灰度值随着LPS处理时间延长而升高，PAI-1和HMGB1的三个时间点、SP-B的24 h时点与对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），并且24 h或12 h与6 h时点间差异有统计学意义（P < 0.05）；sRAGE灰度值随着LPS处理时间延长而降低，并在24 h时点与对照组及其他时间点的差异有统计学意义（P < 0.05），见表 5和图 4。

GAPDH代表内参条带；对照组和LPS组分别有6、12和24 h时点 图 4 四项生物标志物Western blot电泳图 Fig 4 Western blot electrophoresis of four biomarkers

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现有的传统临床指标已严重滞后于ARDS病情进展，因为机体自身具有呼吸代偿能力，PaO₂在ARDS初期降低并不明显，随着病情发展，呼吸能力失代偿后PaO₂才会出现明显降低^[1]。因此等到临床症状明显时，机体已失去代偿空间，此时采用治疗措施已回天乏术，这也是ARDS病死率改善不明显的重要原因之一^[6]。笔者前期研究也发现轻中度ARDS因缺乏有效干预措施后可恶化成重度ARDS，早、晚期病死率高达47.6%及61.9%^[7-8]。寻找合适的生物标志物并非易事，ARDS病理生理机制复杂，发病时病原体释放脂多糖等多种致病因子通过结合Toll样受体4通路、焦亡通路等^[9]，激活多种炎症因子和效应蛋白表达释放，促使炎症细胞浸润、肺上皮细胞或血管内皮细胞死亡等^[10]。现已发现ARDS有关的生物标志物就有20余种，如何选择是临床医生需要面临的挑战，因为患者自身条件复杂多变，往往也影响了生物标志物的效价^[11]。

为此本研究选择采用ARDS动物模型，为生物标志物的选择提供参考。结果显示，在ARDS大鼠的血清、肺泡灌洗液和肺组织中，SP-B、PAI-1和HMGB1在6 h即有升高，且差异有统计学意义，提示血清或者BALF中各种生物标志物在早期诊断上等同甚至优于常规临床指标^[12]。以下是本研究选择这四种细胞来源的考虑因素。

SP-B是由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成并分泌到肺泡表面的一种具有表面活性的疏水性小蛋白，相对分子质量为5 000~8 000，生理作用是促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子层，增加肺顺应性、降低肺泡表面张力、防止呼气末肺泡塌陷^[13]。血清SP-B浓度在ARDS大鼠模型6 h已明显升高，且随着LPS处理的时间延长而升高更明显，并且BALF与血清浓度变化趋势一致，这验证了SP-B可作为生物标志物的可靠性。

PAI-1主要来源于血管内皮细胞，相对分子质量为43 000，属于丝氨酸蛋白酶抑制物家族成员，是纤溶系统的主要调节因子，为组织型纤溶酶原活化剂（tissue plasminogen activator，t-PA）和尿激酶型纤溶酶原活化剂（urokinase plasminogen activator，u-PA）的主要生理抑制剂，主要生理作用是灭活t-PA和u-PA，抑制纤溶过程，促进血栓形成，是体内纤溶系统关键的调节因子^[14]。ARDS发生时机体凝血纤溶系统失衡，使PAI-1生成增多，引起高凝低纤溶状态^[15]。与此同时，由于ARDS中凝血纤溶指标蛋白C分泌减少和活性降低，灭活PAI-1的能力下降，引起肺泡及肺血管中纤维蛋白沉积，增加肺纤维化的发生^[16]。本研究发现PAI-1在血清和BALF中浓度变化趋势与SP-B基本一致，但其组织内表达增加在6 h内即可出现，且早于SP-B和HMGB1，因此PAI-1可作为ARDS早期标志物，并且提示纤溶系统在ARDS早期阶段已激活，后期肺纤维化的出现考虑与纤溶系统失代偿有关。

HMGB存在真核生物细胞核内，有3个成员，即HMGB1、HMGB2和HMGB3。其中HMGB1含量最为丰富，相对分子质量为30 000^[17]。ARDS发生时，HMGB1和炎性因子形成相互效应，一方面炎性因子可刺激HMGB1的释放，炎症细胞受到刺激后将HMGB1释放到胞外；另一方面，HMGB1又可以作用于促炎因子，促使后者释放许多炎症介质，参与氧化趋化因子介导炎症反应，使中性粒细胞浸润而导致ARDS的发生，最终加重肺损伤^[18]。以往研究认为HMGB1是晚期炎症因子，本研究也发现其激活应该在ARDS发生后6~12 h之间，确实晚于白介素及肿瘤坏死因子的激活，但具体的浓度峰值仍需探讨。然而此“晚期”并不影响其作为24 h内ARDS的生物标志物。

RAGE分子有3种，分别是全长RAGE（n-RAGE）、内源性分泌型RAGE（esRAGE）及可溶性RAGE（sRAGE），其中sRAGE是由RAGE胞外段经溶蛋白性裂解作用裂解形成的^[19]，相对分子质量为26 100，主要来源于内皮细胞。炎症发生时，炎症因子启动早期抑制HGMB1-RAGE信号通路，sRAGE通过受损的肺泡壁和毛细血管壁渗透到肺泡水肿液和血液中，与RAGE竞争结合，可抑制肺内中性粒细胞聚集和炎症因子产生，对ARDS肺损伤具有保护作用^[20]。本研究显示肺内外sRAGE呈减少趋势，提示其可能与其他三种生物标志物病理生理机制不同，可能与sRAGE的生成减少及消耗相关。

本研究有以下局限性：首先，仅观察了24 h内的四项生物标志物水平，并未关注24 h后的变化；其次，虽然发现其中三项标志物的一致性变化，但仍需严格的实验设计探讨三者的病理生理机制关系；第三，只选择四项生物标志物单独进行分析，需结合组合方案进行临床二次验证^[21]。

综上所述，本研究借助ARDS动物模型，发现SP-B、PAI-1和HMGB1在血清、支气管肺泡灌洗液及肺组织中呈一致性变化，选择其一或组合检测均可协助临床医师早期诊断ARDS。

作者个人贡献声明 林锦乐和史旻为共同第一作者。林锦乐参与课题设计、论文撰写及标本检测；史旻参与实验模型构建、标本检测和论文撰写；卫剑、叶剑滨和傅萱参与动物模型构建及标本采集；卢彦秀，曾世永和陶伍元参与文献的整理与分析；窦清理负责对论文修改及校正；张文武全程参与课题设计、实验指导及论文修改

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突