2020, Vol. 29
2 郑州大学第一附属医院综合ICU 450052;
3 河南省重症医学重点实验室，郑州 450052;
4 郑州市脓毒症重点实验室 450052
2 General ICU, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China;
3 Henan Key Laboratory of Critical Care Medicine, Zhengzhou 450052, China;
4 Zhengzhou Key Laboratory of Sepsis, Zhengzhou 450052, China
心肌纤维化是多种心血管疾病共有的病理过程，包括高血压、心肌梗死、瓣膜病、心肌炎和心力衰竭。研究发现在终末期心衰患者心脏中有大量胶原沉积，同时在各种心血管疾病动物模型中也观察到心肌纤维化贯穿在各种心血管疾病的病理过程始终[1]。大量心肌纤维化造成心脏僵硬度增加，早期引起心脏舒张功能障碍，同时大量胶原导致心肌细胞之间紧密连接损伤，导致心肌细胞之间电传导异常，引起各种心律失常，在疾病晚期心肌纤维化影响心脏兴奋收缩耦联，最终影响心脏收缩功能，引起心力衰竭[2]。目前临床上尚无针对心肌纤维化的特异性治疗方法，因此发现新的特异性抗心肌纤维化药物至关重要。
利拉鲁肽是一类新型的糖尿病治疗药物，其为胰高血糖素样肽- 1（glucagon-like peptide1，GLP-1）的类似物，可通过促进胰岛素合成及分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食欲、延迟胃排空来降低血糖[3]。最近研究发现利拉鲁肽对多种心血管疾病具有保护作用[3-6]，可延缓压力负荷诱导的心肌肥厚和纤维化[7]，可减轻非糖尿病患者心力衰竭[4]，以及延缓链脲霉素诱导的Ⅰ型糖尿病心肌纤维化[8]。然而其是否可直接作用于成纤维细胞尚未见报道。本研究旨在探讨利拉鲁肽对大鼠心肌成纤维细胞的直接作用。
1 材料与方法 1.1 药品和试剂血管紧张素Ⅱ（angiotensin, AngⅡ）和蛋白激酶B（AKT）激活剂SC79购买于美国Sigma公司。本实验所有一抗包括：总（total, T-）AKT、smad2、smad3以及磷酸化的（phosphorylated，p-）AKT、smad2、smad3购买于美国Cell Signaling Technology公司；smad4、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）购买于美国Santa Cruz公司；平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）抗体和Ⅲ型胶原抗体购买于美国abcam公司。本实验所有二抗包括山羊抗兔IRdye@800 CW IgG和山羊抗小鼠IRdye@800 CW购买于美国LI-COR公司；逆转录试剂盒购买于美国Roche公司；细胞培养所用DMEM-F12培养基，胎牛血清，胰酶购买于美国Gibco公司。
1.2 细胞培养本研究动物实验方案通过郑州大学伦理委员会审批（ZZDX-2019-1204）。本研究全程遵循动物实验伦理和福利原则。取出生3 d的SD大鼠乳鼠（购买于北京华富康公司）麻醉后固定，75%酒精消毒后用剪刀剪开胸腔，快速取出心脏，去除心房和右心室后置于预冷的D-hanks液中冲洗，在DMEM-F12培养基中剪碎后置于含有0.125%的胰酶消化5次，每次10 min，收集消化液离心去上清液，将细胞在含有15% FBS的DMEM-F12中重悬，用40 μm过滤网过滤后接种于10 cm大皿中，90 min后贴壁细胞即为心肌成纤维细胞，采用α-SMA染色进行鉴定。
1.3 细胞处理传2~3代用于本次细胞实验。检测细胞活性：将细胞分为不同浓度的利拉鲁肽处理组（0、1、50、100、200 nmol/L），细胞接种于96孔板，24 h后分别给予0、1、50、100、200 nmol/L的利拉鲁肽处理，48 h后采用CCK8检测细胞活性；检测细胞增殖：将细胞接种于96孔板，24 h后给予1 μmol/L的AngⅡ处理（AngⅡ组），不同浓度利拉鲁肽处理组同时给予1 μmol/L的AngⅡ和1、50、100、200 nmol/L的利拉鲁肽处理48 h。细胞给予1 μmol/L的AngⅡ，200 nmol/L的利拉鲁肽和10 μmol/L的SC79处理（AKT激活剂SC79组）。采用MTT检测细胞增殖。
荧光染色、RT-PCR和免疫印迹处理：细胞分别接种于24孔板/6孔板和10 cm大皿，24 h后给予1 μmol/L的AngⅡ处理（AngⅡ组），不同浓度利拉鲁肽处理组同时给予1 μmol/L的AngⅡ和利拉鲁肽（1、50、100、200 nmol/L）处理48 h。
1.4 细胞活性及细胞增殖检测CCK8检测细胞活性。在96孔板中加入10 μL的配置好的CCK8溶液，在培养箱中孵育2 h，采用酶标仪检测450 nm吸光度，设置只加细胞不作任何处理的孔板对照，每组细胞相对活性=A样本/A孔板对照×100%。
MTT检测细胞增殖。在96孔板加入10 μL配置好的MTT溶液（5 mg/mL），在培养箱中孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，酶标仪检测570 nm吸光度。设置只加细胞不作任何处理的孔板对照，每组细胞相对增殖=A样本/A孔板对照×100%。
1.5 免疫荧光染色细胞处理后加入4%多聚甲醛固定5 min，采用0.02% Triton100通透5 min，采用PBS洗涤后用8%羊血清封闭1 h，采用抗-α-SMA和抗Ⅲ型胶原抗体（1:100稀释）共同孵育细胞爬片过夜，采用红色和绿色荧光二抗孵育细胞爬片，采用DAPI进行核染色，在荧光显微镜下观察拍照。
1.6 RT-PCR采用Trizol进行细胞总RNA提取，采用分光光度计测量A260/A280，A230/A260比值计算RNA浓度和纯度，采用逆转录试剂盒将2 μg RNA进行反转录，采用LightCycler 480 SYBR® Green 1 Master Mix体系进行PCR扩增，5 min 95 ℃变性，之后开始42次引物扩增循环。PCR结果使用双重标准化曲线来量化，使用GAPDH的mRNA表达进行校准。所用引物序列见表 1。
| mRNA | 正向引物 | 反向引物 |
| 胶原Ⅰ | GAGAGAGCATGACCGATGGATT | TGGACATTAGGCGCAGGAA |
| 胶原Ⅲ | AAGGGCAGGGAACAACTGAT | GTGAAGCAGGGTGAGAAGAAAC |
| TGFβ | GGAAGACACATTTGGCCCTG | GCAATTTTAGGCGTCCGGAT |
| GAPDH | GACATGCCGCCTGGAGAAAC | AGCCCAGGATGCCCTTTAGT |
| 注：序列顺序为5’→3’ | ||
采用SDS裂解液裂解细胞，采用BSA法进行蛋白浓度检测，采用SDS-PAGE进行电泳，将蛋白转到PVDF膜上后孵育相应的一抗，采用DAB化学发光法进行显色反应。采用ImageLab软件进行分析。
1.8 统计学方法采用SPSS 23.0软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组样本比较采用单因素方差分析，事后检验采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 利拉鲁肽减轻AngⅡ诱导的成纤维细胞增殖CCK8结果显示，不同浓度利拉鲁肽处理成纤维细胞48 h后，各浓度组间细胞活性与对照组比较，差异无统计学意义（F=1.59, 均P > 0.05）。MTT结果显示，AngⅡ处理成纤维细胞后，细胞增殖明显高于对照组（F=231.22，均P < 0.05），不同浓度利拉鲁肽组细胞增殖活性均明显低于AngⅡ组（P < 0.05），见图 1。
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| 与对照组比较，aP < 0.05；与AngⅡ组比较，bP < 0.05 图 1 各组成纤维细胞活性和细胞增殖 Fig 1 Cell viability and proliferation in each group |
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免疫荧光染色结果显示，AngⅡ组成纤维细胞α-SMA和Ⅲ型胶原的表达明显高于对照组（F=178.23和134.45，与对照组相比，均P < 0.05）；而100、200 nmol/L利拉鲁肽组的成纤维细胞α-SMA和Ⅲ型胶原的表达明显低于AngⅡ组（均P < 0.05），见图 2。
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| 红色表示Ⅲ型胶原，绿色表示α-SMA（平滑肌肌动蛋白α），蓝色表示细胞核，放大倍数200倍；与对照组相比，aP < 0.05；与AngⅡ组相比，bP < 0.05；Lir为利拉鲁肽 图 2 各组成纤维细胞α-SMA和Ⅲ型胶原的表达 Fig 2 The expression levels ofα-SMA and collagen Ⅲ in each group |
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RT-PCR和免疫印迹结果显示，AngⅡ组的成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA和转化生长因子β1（transforming growth factor-β1, TGFβ1）的mRNA和蛋白水平表达明显高于对照组（F值分别为121.23、143.32、125.43、98.21；与对照组相比，均P < 0.05）；而100、200 nmol/L利拉鲁肽组的成纤维细胞中上述致纤维化因子的mRNA表达明显低于AngⅡ组（均P < 0.05），见图 3和表 2。
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| A：mRNA表达水平；B：蛋白表达水平；与对照组相比，aP < 0.05；与AngⅡ组相比，bP < 0.05；Lir为利拉鲁肽；α-SMA为平滑肌肌动蛋白α；TGFβ1为转化生长因子β1 图 3 各组成纤维细胞致纤维化因子的mRNA和蛋白的表达 Fig 3 The mRNA and protein levels of pro-fibrosis factors in each group |
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| 组别 | Ⅰ型胶原 | Ⅲ型胶原 | α-SMA | TGFβ1 |
| 对照组 | 0.22±0.03 | 0.31±0.03 | 0.29±0.04 | 0.31±0.03 |
| AngⅡ | 0.56±0.03a | 0.98±0.05a | 0.59±0.08a | 0.87±0.07a |
| AngⅡ+100 nmol/L Lir | 0.21±0.01b | 0.11±0.05b | 0.15±0.03b | 0.22±0.05b |
| AngⅡ+200 nmol/L Lir | 0.19±0.05b | 0.21±0.04b | 0.23±0.03b | 0.17±0.04b |
| F值 | 78.65 | 152.56 | 116.76 | 134.54 |
| 注：Lir为利拉鲁肽；α-SMA为平滑肌肌动蛋白α；TGFβ1为转化生长因子β1；与对照组相比，aP < 0.05；与AngⅡ组相比，bP < 0.05 | ||||
免疫印迹结果显示，AngⅡ组成纤维细胞中smad2、smad3和smad4蛋白磷酸化（p）表达明显高于对照组（F值分别为32.12、42.32、26.54；与对照组相比，均P < 0.05）；而200 nmol/L利拉鲁肽组成纤维细胞中smad2，smad3和smad4蛋白磷酸化水平与AngⅡ组比较，差异无统计学意义（均P > 0.05）。AngⅡ组的成纤维细胞中AKT的磷酸化水平明显高于对照组（F=112.73；P < 0.05）；200 nmol/L利拉鲁肽组的成纤维细胞中AKT的磷酸化蛋白水平显著低于AngⅡ组（P < 0.05），见图 4。
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| 与对照组相比，aP < 0.05；与AngⅡ组相比，bP < 0.05 图 4 各组成纤维细胞中信号分子的蛋白表达 Fig 4 Protein levels of signaling moleculars in each group |
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免疫荧光染色结果显示，AngⅡ组的成纤维细胞α-SMA和Ⅲ型胶原的表达明显高于对照组（F=23.54和31.19；与对照组相比，均P < 0.05）；而200 nmol/L利拉鲁肽+SC79组的成纤维细胞α-SMA和Ⅲ型胶原的表达明显与AngⅡ组比较，差异无统计学意义（均P > 0.05），见图 5。
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| 红色表示Ⅲ型胶原，绿色表示α-SMA，蓝色表示细胞核，放大倍数200倍；与对照组相比，aP < 0.05 图 5 各组成纤维细胞α-SMA和Ⅲ型胶原的表达 Fig 5 The expression levels ofα-SMA and collagenⅢ in fibroblasts in each group |
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心肌纤维化是各种心血管疾病的共有病理过程，可介导心脏舒缩功能障碍，促进心力衰竭的发生[9-10]。多种细胞参与心肌纤维化的发生发展，包括心脏固有的成纤维细胞、内皮细胞、上皮来源的细胞以及血液来源的干细胞等[1, 11]。在众多细胞中，心脏固有的成纤维细胞发挥主要作用，占心脏细胞数量的70%。在生理条件下，心脏成纤维细胞可分泌少量胶原纤维以维持心脏的固有结构和功能，然而在病理条件下，成纤维细胞活化（表达大量α-SMA）、增殖并分泌大量胶原纤维和促纤维化因子（包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA和TGFβ1），促进心肌纤维化的发生发展[12-13]。本研究发现新型抗糖尿病药物利拉鲁肽，能够直接作用于心脏固有的成纤维细胞，抑制血管紧张素诱导的细胞活化增殖和分泌功能。
多种内分泌因子参与心脏成纤维细胞的激活，包括TGFβ1、AngⅡ、内皮素-1、血小板源性生长因子以及一些促炎因子。上述因子通过直接结合到成纤维细胞表面受体，激活下游的信号分子，从而促进成纤维细胞表达和分泌胶原蛋白和促胶原因子：Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、结缔组织生长因子、TGFβ1和α-SMA等[14-15]。在心血管疾病的发生发展过程中，AngⅡ是高血压、心肌梗死、缺血性心肌病的重要致病因子[16]。AngⅡ可以与TGFβ1信号通路交联促进smad2和smad3蛋白的磷酸化，磷酸化的smad2与smad3结合，与smad4结合形成复合物，从细胞质转移至细胞核，发挥对促纤维化基因的转录调控作用[17]。以往的研究发现利拉鲁肽可以延缓压力负荷诱导的心肌肥厚和纤维化[7]，延缓链脲霉素诱导的Ⅰ型糖尿病心肌纤维化[8]。有报道称利拉鲁肽通过激活AMPKα改善压力负荷诱导的心肌纤维化。本研究首先探讨了利拉鲁肽对心脏固有成纤维细胞的作用，分离了原代大鼠乳鼠成纤维细胞，采用AngⅡ刺激的模型诱导成纤维细胞激活增殖和分泌，研究发现1、50、100、200 nmol/L的利拉鲁肽单独处理细胞均不会影响心脏成纤维细胞的活性，但是1、50、100、200 nmol/L的利拉鲁肽均可以减轻AngⅡ刺激导致的成纤维细胞的增殖。于是本研究采用100和200 nmol/L的利拉鲁肽处理检测细胞活化和分泌功能，发现100 nmol/L和200 nmol/L的利拉鲁肽能够有效抑制AngⅡ诱导的细胞活化和分泌。本研究检测了经典的smad通路发现AngⅡ可刺激激活smad信号通路，然而利拉鲁肽并没有明显影响smad2/3蛋白的激活以及smad4蛋白的表达，提示利拉鲁肽并不是通过smad信号通路发挥抗纤维化作用的。
AKT是酪氨酸蛋白激酶受体信号通路中的重要分子，参与调控细胞生存、活化细胞增殖和分泌功能[18]。研究已证实AKT参与心脏纤维化的发生发展。AKT同时参与AngⅡ诱导的心肌纤维化过程[18]。AKT通过其下游的mTOR和GSK3β参与成纤维细胞活化增殖和分泌功能，研究发现抑制AKT可以减轻心肌纤维化的发展[19]。本研究发现AngⅡ刺激明显增加了成纤维细胞AKT的磷酸化激活，而200 nmol/L的利拉鲁肽显著减少AKT的磷酸化激活，且AKT激活剂完全阻断利拉鲁肽的保护作用，提示利拉鲁肽可能通过抑制AKT信号通路发挥抗纤维化作用。
综上所述，利拉鲁肽可以直接作用于心脏固有的成纤维细胞，抑制AngⅡ刺激下的成纤维细胞活化增殖和分泌功能，因此有可能作为新型抗纤维化药物治疗多种心血管疾病，抑制心肌纤维化进展。
致谢: 感谢郑州大学公共卫生学院王凯娟教授对本研究统计学处理的指导和论文书写的修改和建议
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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