脓毒性心肌病是因脓毒症或脓毒性休克诱导的可逆性心肌抑制性病变，主要由于心肌能量代谢障碍或心肌直接损伤从而导致心肌抑制，并不出现大面积的心肌坏死，主要表现为左心室扩张、射血分数（ejection fraction, EF）下降，患者心功能在7~10 d可逐渐恢复^[1-2]。虽然脓毒性心肌病在临床上比较常见，但其发病机制尚未完全阐明。有研究认为，免疫因素参与了脓毒性心肌病的发病过程，特别是多种免疫分子的表达失衡可能加速了脓毒性心肌病的进展^[3-4]。CD100是免疫信号素的家族成员，在机体内发挥生物学作用的形式包括可溶型CD100（soluble CD100, sCD100）和膜型CD100（membrane-bound CD100, mCD100），不但具有调控免疫系统重要生理功能的作用，还参与多种心脏疾病（包括心力衰竭、冠心病等）的发病过程^[5-6]。但有关CD100在脓毒性心肌病中的作用和相关机制尚未见报道。因此，本研究旨在观察CD100在脓毒性心肌病患者中的表达水平，探讨CD100参与脓毒性心肌病发病的可能机制。

本研究为前瞻性队列研究。纳入2019年1月至2019年10月在武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属普爱医院心血管内科或重症监护室住院的脓毒症患者（脓毒症组）和脓毒性心肌病患者（脓毒性心肌病组）。脓毒症患者纳入标准：⑴年龄≥18岁且≤70岁；⑵诊断符合2016年国际脓毒症专家共识的诊断标准：可疑感染者、序贯器官衰竭评分（sequential organ failure assessment, SOFA）增加2分及以上者^[7-8]。脓毒性心肌病患者纳入标准：⑴符合脓毒症患者纳入标准；⑵入院后24 h内行经胸超声心动图检查，EF < 50%且较基础水平下降超过10%，2周内恢复，基础EF值参考患者入院前至少1个月的心脏彩超结果^[9]。排除标准：⑴急性冠脉综合征；⑵应激性心肌病；⑶恶性肿瘤；⑷重要脏器功能不全；⑸自身免疫性疾病长期使用免疫抑制剂者；⑹合并乙肝、丙肝或HIV的患者。另选择同期在本院进行查体的健康对照者为对照组。本研究获得武汉市第四医院/华中科技大学同济医学院附属普爱医院伦理委员会批准（批准号：KY2020-123-01），所有患者及家属均行告知并签署知情同意书。

人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL）购自北京索莱宝科技有限公司；CD4⁺T细胞分选试剂盒、CD8⁺T细胞分选试剂盒购自德国美天旎公司；重组人CD100购自北京ACRO公司；抗CD3-APC、抗CD4-FITC、抗CD8-APC Cy7购自美国BD公司；抗CD100-PE购自美国R & D公司；sCD100、干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）、白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测试剂盒购自武汉华美公司；TriPure RNA提取试剂、反转录试剂盒、FastStart DNA Master SYBR GreenⅠ实时定量PCR试剂盒均购自瑞士罗氏公司；穿孔素、颗粒酶B酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）检测试剂盒购自美国Abcam公司。FACS AriaⅡ流式细胞仪为美国BD公司产品；MACS细胞磁力分离架为德国美天旎公司产品；微孔读板仪为美国伯乐公司产品；LightCycler实时定量PCR仪为瑞士罗氏公司产品。

脓毒症和脓毒性心肌病患者于就诊本院24 h内、健康对照者于清晨空腹分别采集非抗凝静脉外周血3 mL和EDTA抗凝静脉外周血10 mL。非抗凝外周血于3 000 r/min离心10 min，留取上层血清，冻存于-80 ºC备用。EDTA抗凝外周血使用人淋巴细胞分离液、采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），冻存于液氮中备用。

分别使用CD4⁺T细胞分选试剂盒和CD8⁺T细胞分选试剂盒、采用磁力分离法分选PBMC中的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，按说明书进行操作。分别取5×10⁵个CD4⁺T细胞和5×10⁵个CD8⁺T细胞，加入终浓度为1 μg/mL的抗CD3/CD28刺激培养，同时加入终浓度为2 μg/mL的重组人CD100共刺激培养，24 h后收集细胞和培养上清液进行后续试验。

ELISA法检测血清sCD100表达，操作按说明书进行。使用抗CD3-APC、抗CD4-FITC、抗CD8-APC Cy7和抗CD100-PE对PBMC进行表面染色，流式细胞术检测PBMC中CD100⁺CD4⁺和CD100⁺CD8⁺细胞比例。ELISA法检测培养上清液中IFN-γ、IL-17、IL-10和TNF-α表达，操作按说明书进行。实时定量PCR法对CD4⁺T细胞中T-bet、FoxP3和RORγt mRNA相对表达量进行检测，提取CD4⁺T细胞总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL，反应条件：预变性95 ºC 30 s，PCR反应95 ºC 5 s，60 ºC 30 s。应用2^-ΔΔCT法分析目的基因的相对表达量。引物序列^[10]：T-bet正向5’-CGG CTG CAT ATC GTT GAG GT-3’，T-bet反向5’-GTC CCC ATT GGC ATT CCT C-3’；RORγt正向5’-GCA GCG CTC CAA CAT CTT CT-3’，RORγt反向5’-ACG TAC TGA ATG GCC TCG GT-3’；FoxP3正向5’-CAC CTG GCT GGG AAA ATG G-3’，FoxP3反向5’-GGA GCC CTT GTC GGA TGA-3’；β-actin正向5’-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3’，β-actin反向5’-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3’。ELISPOT法对CD8⁺T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的斑点形成细胞数量（spot forming cells, SFC）进行检测，操作按说明书进行。

应用SPSS 21.0进行统计分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析、t检验及配对t检验；非正态分布的计量资料采用中位数（四分位数）[M(Q_L, Q_U)]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、Wilcoxon配对检验。计数资料采用频数（百分率）表示，组间比较采用卡方检验。采用受试者工作者特征（receiver operating characteristic, ROC）分析CD100预测患者28 d生存结局的效能。以P < 0.05为差异有统计学意义。

对照组、脓毒症组、脓毒性心肌病组在性别组成、年龄方面的差异无统计学意义（均P > 0.05）。脓毒症组和脓毒性心肌病组的体温、白细胞、血小板和28 d病死率等指标与对照组比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05），但上述指标及C反应蛋白、降钙素原在脓毒症组和脓毒性心肌病组之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。脓毒性心肌病组的乳酸、APACHE Ⅱ评分和SOFA评分均高于脓毒症组，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 1。

脓毒性心肌病组血清sCD100表达水平较对照组和脓毒症组均降低（t=16.77和12.33，均P < 0.01），但sCD100在脓毒症组和对照组之间的差异无统计学意义（t=0.277，P=0.861）。三组CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表面CD100表达的典型流式检测如图 1。脓毒性心肌病组mCD100⁺CD4⁺T细胞比例较对照组和脓毒症组均升高（t=21.72和24.75，均P < 0.01），但mCD100⁺CD4⁺T细胞比例在脓毒症组和对照组之间的差异无统计学意义（t=0.261，P=0.869）。脓毒性心肌病组mCD100⁺CD8⁺ T细胞比例较对照组和脓毒症组均升高（t=35.82和13.29，均P < 0.01），脓毒症组mCD100⁺CD8⁺ T细胞比例较对照组亦升高（t=18.97，P < 0.01），见表 2。

图 1 对照组、脓毒症组和脓毒性心肌病组CD4+ T细胞和CD8+ T细胞表面CD100表达的典型流式细胞检测 Fig 1 CD100 expression on CD4+ T cells and CD8+ T cells by flow cytometry in the control, sepsis, and septic cardiomyopathy groups

图选项

根据脓毒性心肌病患者入院后28 d生存结局，将19例患者分为存活组（n=14）和死亡组（n=5），死亡组患者血清sCD100表达水平较存活组降低，但死亡组患者mCD100⁺CD4⁺ T细胞和mCD100⁺CD8⁺ T细胞比例均较存活组升高（表 3）。将存活组和死亡组患者血清sCD100、mCD100⁺CD4⁺ T细胞比例和mCD100⁺CD8⁺ T细胞比例进行ROC曲线分析，如图 2，曲线下面积（area under curve, AUC）分别为0.814、0.907和0.935，P值分别为0.042、0.008和0.004，提示血清sCD100、mCD100⁺CD4⁺T细胞和mCD100⁺CD8⁺T细胞比例预测患者生存结局效能均较好。

A：sCD100预测患者预后（AUC=0.814，P=0.042）；B：mCD100+CD4+T细胞比例预测患者预后（AUC=0.907，P=0.008）；C：mCD100+CD8+T细胞比例预测患者预后（AUC=0.935，P=0.004） 图 2 预测脓毒性心肌病预后的ROC曲线 Fig 2 The ROC curve of prognosis of septic cardiomyopath

图选项

使用重组人CD100刺激脓毒性心肌病患者CD4⁺T细胞24 h后，培养上清液中Th1型细胞因子IFN-γ和Th17型细胞因子IL-17分泌水平升高，但调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）型细胞因子IL-10分泌水平降低。CD4⁺T细胞中Th1转录因子T-bet和Th17转录因子RORγt mRNA相对表达量升高，Treg转录因子FoxP3 mRNA相对表达量降低，见表 4。

使用重组人CD100刺激脓毒性心肌病患者CD8⁺T细胞24 h后，培养上清液中IFN-γ和TNF-α的分泌水平升高，分泌穿孔素和颗粒酶B的水平亦升高，见表 5。

CD100在脓毒症和脓毒性心肌病中的表达和功能尚未见相关报道。本研究发现，脓毒性心肌病患者外周血sCD100水平较脓毒症患者和健康对照者均升高，但外周血T细胞表面mCD100水平则较脓毒症患者和对照组降低，这与既往在慢性病毒感染性疾病（包括：乙肝^[11]、丙肝^[12]、艾滋病^[13]等）中的研究结果一致，但脓毒症患者中CD100的表达与对照组比较未见明显变化。由于CD100参与了心衰、冠心病等心脏疾病的发病过程^[5-6]，提示脓毒性心肌病患者CD100的表达变化可能主要与心肌功能受到抑制有关，与脓毒症疾病过程可能无关。sCD100是发挥免疫调节活性的主要形式，表达于免疫细胞表面的mCD100尚未证实存在免疫调控活性，同时，亦未发现sCD100的产生与CD100 mRNA的剪接水平不同相关，sCD100的主要来源是由活化的淋巴细胞表面的mCD100经酶切脱落而来^[14-15]，因此，机体内存在sCD100和mCD100的平衡。脓毒性心肌病患者外周血T细胞中mCD100的表达升高与血清sCD100的水平降低密切相关，可能与T细胞表面CD100的脱落受到抑制有关。另外，sCD100还可促进单核巨噬细胞活化^[16]，增强血管生成潜能^[17]，sCD100降低可通过抑制上述因素促进脓毒性心肌病的进展。因此，sCD100降低和mCD100升高可能成为脓毒性心肌病患者生存预后不良的重要预测因素之一。

脓毒症和脓毒性心肌病患者中存在T细胞功能障碍^[18-19]，而CD100对T细胞具有免疫调控作用。在免疫复合体性肾小球肾炎中，CD100可增强CD4⁺T细胞功能^[20]。CD4⁺T经过不同转录因子作用分化为Th1、Th17及Treg亚群，本研究结果提示，CD100可增强脓毒性心肌病患者Th1和Th17细胞功能，抑制Treg活性，因此，sCD100的表达减少抑制了脓毒性心肌病患者CD4⁺T细胞的免疫应答。

在乙肝病毒感染小鼠模型中，重组人CD100刺激可增加病毒特异性CD8⁺T细胞的抗病毒活性，促进乙肝病毒清除^[11]。在丙肝患者中，腺病毒介导的CD100转染人CD8⁺T细胞可诱导抗病毒活性增强^[12]。CD8⁺T细胞可通过穿孔素-颗粒酶途径直接杀伤靶细胞，还可通过分泌细胞因子诱导靶细胞死亡^[21]。CD100可促进脓毒性心肌病患者CD8⁺T细胞穿孔素和颗粒酶B分泌增加，IFN-γ和TNF-α水平升高，提示CD100可增强CD8⁺T细胞的直接杀伤和非细胞杀伤活性，而脓毒性心肌病患者中sCD100的表达减少不足以维持CD8⁺T细胞的功能，导致细胞免疫功能障碍。

综上所述，脓毒性心肌病患者T细胞表面CD100的脱落受到抑制，导致血清sCD100表达降低及T细胞表面mCD100表达升高，诱导T细胞功能障碍，对脓毒性心肌病患者的预后不良有重要提示意义。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突