2021, Vol. 30
脓毒症发生过程中，肠道上皮细胞受到脂多糖、炎性因子等损伤因素的打击从而发生通透性增加及坏死脱落[1]。此时肠道屏障功能受损，肠道细菌及毒素出现移位，进入循环系统，使全身炎症反应综合征进一步加剧和失控[2]，故揭示肠上皮细胞在脓毒症过程中的损伤机制具有重要意义[3-4]。
长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）被证明在脓毒症引起的各种器官损伤中扮演重要角色，可能成为新的脓毒症器官损伤治疗策略的切入点[5]。为了找到脓毒症中可能参与肠道上皮细胞损伤的lncRNA，笔者对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理的人小肠上皮细胞（HIEC-6）进行了全转录组RNA测序，结果发现LncRNA-TUG1在LPS处理后的HIEC-6细胞中显著降低。LncRNA-TUG1可以减轻脓毒症诱导的肺损伤和心肌细胞损伤[6]，但是在脓毒症引起的小肠上皮细胞损伤中，LncRNA-TUG1的功能和机制仍然不清楚，值得进一步研究。
LncRNA作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNAs，ceRNA）吸附microRNA，从而调节靶基因水平的ceRNA理论是目前LncRNA发挥作用的热门机制之一[7]。本研究也从ceRNA理论的角度出发，利用全转录组RNA测序数据和生物信息学分析对LncRNA-TUG1的下游通路进行了筛选。在HIEC-6细胞中LncRNA-TUG1很可能作为ceRNA调控microRNA-132-3p（miR-132-3p），后者能靶向抑制SIRT1。既往研究中miR-132-3p被认为具有细胞生长抑制功能，而SIRT1在脓毒症中具有一定的器官保护作用。因此本研究对LncRNA-TUG1/miR-132-3p/SIRT1通路在脓毒症诱导的小肠上皮细胞损伤中的作用和机制进行了探讨。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂人小肠上皮HIEC-6 (ATCC® CRL-3266TM) 细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）；LPS及表皮生长因子(EGF)购自于德国Merck KgaA公司；siRNA序列、microRNA mimic及引物购自于广州锐博生物科技有限公司；All star阴性转染对照序列购自德国Qiagen公司；Trizol试剂、Lipofectamine®2000转染试剂、RevertAid H Minus Reverse Transcriptase试剂盒及SYBR Green qPCR Master购自美国Thermo Fisher公司；miRNA First Strand cDNA及MicroRNAs qPCR试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量、CCK-8试剂盒、Annexin V-PI细胞凋亡检测及ECL化学发光试剂盒购自北京碧云天生物科技有限公司。SIRT1抗体、GAPDH抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海艾博抗贸易有限公司；Dual Luciferase-Reporter 1000 Assay试剂盒北京普洛麦格生物技术有限公司。
1.2 细胞培养和LPS处理HIEC-6 (ATCC® CRL-3266TM)细胞常规培养于37℃，5%CO2细胞培养箱。培养基使用4%低血清的OptiMEM-1培养基，同时加入10 ng/mL EGF。LPS溶于培养基，处理浓度为1.0 μg/mL。处理对照为无任何药物的正常培养基。
1.3 RNA测序使用LPS处理HIEC-6细胞24 h后，消化收集处理组和对照组细胞，Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。RNA质量检验合格后进行文库构建，Illumina高通量测序平台（HiSeq/MiSeq）进性测序。
1.4 细胞转染为了上调细胞的LncRNA-TUG1，pcDNA3.1-TUG1真核生物表达载体被构建，同时采用pcDNA3.1空质粒作为阴性转染对照。为了下调SIRT1，siRNA-SIRT1混合物被用于转染；为了上调miR-132-3p，对细胞进行miR-132-3p mimic的转染。siRNA及mimic的阴性对照均使用All star对照序列。转染试剂采用Lipofectamine®2000。转染24 h使用qRT-PCR对转染效果进行验证。
1.5 qRT-PCRTrizol试剂提取LPS处理24 h或转染48 h后的各组细胞的总RNA。对总RNA样本进行质量及定量检测后进行cDNA的反转录。为检测LncRNA-TUG1和SIRT1 mRNA，提取的RNA使用RevertAid H Minus Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录，得到的cDNA使用SYBR Green qPCR Master试剂盒进行扩增定量。LncRNA-TUG1的上游引物为：5’-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG-3’下游引物为：5’- CACAAATTCCCATCATTCCC-3’。SIRT1的上游引物为：5’- TAGCCTTGTCAGATAAGGAAGGA-3’下游引物为：5’- ACAGCTTCACAGTCAACTTTGT-3’。内参GAPDH的上游引物为：5’- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’下游引物为：5’- ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。为检测miR-132-3p，总RNA使用miRNA First Strand cDNA合成试剂盒进行反转录。合成的cDNA使用MicroRNAs qPCR试剂盒进行扩增定量；miR-132-3p的上游引物为：5’- TAACAGTCTACAGCCATGGTCG-3’下游引物为试剂盒内通用引物。内参U6的上游引物为：5’- CTCGCTTCGGCAGCACA-3’下游引物为：5’- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。目的基因的相对表达量采用2-△△CT法进行计算。
1.6 Western blot使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液对LPS处理24 h或转染48 h后的各组细胞的总蛋白进行提取。使用12%SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，并进行转膜。5%脱脂奶粉对膜进行室温封闭1 h后，室温下使用兔源性多克隆SIRT1抗体(ab189494)和鼠源性多克隆GAPDH抗体对膜进行一抗孵育2 h，洗涤后室温再使用辣根过氧化物酶标记的抗兔及抗鼠LgG二抗孵育2 h。洗涤后使用增强化学发光法试剂盒对条带进行显示。
1.7 CCK-8检测细胞活力CCK-8试剂盒用于检测各组细胞的活力。处理后的细胞以5 000/孔的密度种植于96孔板，然后继续培养24、48、72及96 h。检测前，弃去孔内原有液体，加入100 μL 1:100稀释的CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h。酶标仪检测450 nm处的光密度（optical density，OD）。
1.8 流式细胞术检测细胞凋亡LPS处理24 h或转染48 h后的各组细胞使用胰酶消化，预冷PBS洗涤3次。使用Annexin V–propidium iodide (PI) apoptosis assay试剂盒对细胞进行染色。弃去PBS后，细胞使用试剂盒中的重悬浮缓冲液进行重悬，分别加入5 μL PI及Annexin V-FITC染料，避光室温染色30 min。使用BD FACSCalibur流式细胞系统(BD Biosciences) 和FlowJo software软件对凋亡率进行分析。
1.9 双荧光酶素报告试验将野生型及突变型LncRNA-TUG1序列插入pMIR-REPORT荧光素酶报告质粒，分别命名为pMIR- TUG1-WT及pMIR- TUG1-Mut。将野生型及突变型SIRT1 3’UTR序列插入pMIR-REPORT荧光素酶报告质粒，分别命名为pMIR- SIRT1-WT及pMIR- SIRT1-Mut.将上述构建好的报告质粒分别与miR-132-3p mimic及All star对照序列进行共转染。使用Dual Luciferase-Reporter 1000 Assay试剂盒对荧光强度进行检测。
1.10 统计学方法统计学分析采用SPSS 17.0进行。数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组间的差异比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 LPS处理的人类小肠上皮细胞存在LncRNA-TUG1、miR-132-3p及SIRT1的表达异常RNA测序分析提示LPS处理24 h的HIEC-6细胞存在一系列mRNA、lncRNA及microRNA的表达变化（图A-C）。其中在测序结果中与对照组相比，LPS处理组细胞中的LncRNA-TUG1变化降低了5.41倍（t=3.26，P < 0.05）。SIRT1的mRNA在LPS处理组细胞中降低了3.26倍（t=2.55，P < 0.05）；接着基于ceRNA理论对LPS处理组中上调的microRNA进行了筛选。Target scan软件提示miR-132-3p可以靶向SIRT1 mRNA的3端非翻译区（3’-UTR）。LncBase软件提示miR-132-3p与LncRNA-TUG1存在互补结合序列。因此miR-132-3p被进一步选做研究对象。在测序数据中miR-132-3p在LPS处理组细胞中升高了4.26倍（t=4.12，P < 0.05）。接着使用qRT-PCR和Western blot对RNA测序数据进行了验证，LPS处理确实可以显著降低LncRNA-TUG1（图 1 D，t=5.69，P < 0.05）及SIRT1的mRNA（t=5.712，P < 0.05）和蛋白表达（图 1 E及f），但是miR-132-3p的表达在LPS处理后出现显著增加（t=3.88，P < 0.05, 图 1 G）。
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| A-C：RNA测序数据显示LPS处理24 h后HIEC-6细胞出现了部分lncRNA、mRNA及microRNA的表达差异；D：qRT-PCR结果显示LPS处理24 h后HIEC-6细胞出了LncRNA-TUG1的表达降低；E-F：qRT-PCR及western blot的结果显示LPS处理24 h后HIEC-6细胞的SIRT1 mRNA及蛋白水平出现降低；G：qRT-PCR结果显示LPS处理24 h后HIEC-6细胞出了LncRNA-TUG1的表达降低。与对照组比较，aP < 0.05 图 1 脂多糖处理24 h后的HIEC-6细胞出现lncRNA-TUG1、miR-132-3p及SIRT1的表达变化 Fig 1 Expression changes of LncRNA-TUG1, miR-132-3p and SIRT1 in HIEC-6 cells treated with LPS for 24 h |
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LPS处理可以有效抑制HIEC-6细胞的增殖（图 2A），并诱导凋亡(图 2B)；在过表达LncRNA-TUG1后（图 2C）再使用LPS处理细胞，可以发现LPS引起的细胞损伤得到减轻，与未经转染的细胞相比，过表达LncRNA-TUG1的细胞增殖抑制减少（图 2 D，t=6.55，P < 0.05），凋亡减少（图 2 E，t=3.94，P < 0.05）。
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| A：CCK-8分析显示LPS处理可以显著抑制HIEC-6细胞的增殖；B：流式细胞分析提示LPS处理24 h可以引起HIEC-6细胞凋亡；C：qRT-PCR验证了pcDNA3.1-TUG1用于过表达LncRNA-TUG1的效果；D：CCK-8分析显示过表达LncRNA-TUG1部分消除了LPS引起的增殖抑制；E：流式细胞分析提示过表达LncRNA-TUG1部分消除了LPS引起的细胞凋亡。与转染pcDNA3.1空质粒相比较，aP < 0.05。 图 2 LncRNA-TUG1的过表达可以减轻LPS诱导的HIEC-6细胞损伤 Fig 2 Overexpression of LncRNA-TUG1 alleviated LPS-induced injury in HIEC-6 cells |
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在过表达LncRNA-TUG1后，可观察到LPS处理的HIEC-6细胞中出现了miR-132-3p的下调（图 3A，t=4.66，P < 0.05）及SIRT1 mRNA水平（t=3.91，P < 0.05）和蛋白水平的增加（图 3 B及C）。转染miR-132-3p mimic后（图 3 D），SIRT1 mRNA水平（t=4.08，P < 0.05）和蛋白水平均出现降低（图 3E及f）。双荧光素酶报告试验发现，在转染miR-132-3p mimic后，转染有pMIR-TUG1-WT及pMIR-SIRT1-3’UTR-WT报告质粒的细胞出现了显著的荧光值降低（图 4A及B，t=5.76，P < 0.05），提示LncRNA-TUG1可以结合miR-132-3p。miR-132-3p过表达和敲减SIRT1（图 4C）使得LncRNA-TUG的细胞保护作用被部分抵消（图 4D及R），表现为与仅转染pcDNA3.1-LncRNA-TUG的细胞相比，共转染miR-132-3pmimic和siRNA-SIRT1的细胞增殖率较低（t=4.55，P < 0.05以及t=5.67，P < 0.05），凋亡率较高t=3.90，P < 0.05以及t=4.22，P < 0.05）。
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| A：qRT-PCR显示过表达LncRNA-TUG1可以抑制HIEC-6细胞的miR-132-3p的水平；B-C：qRT-PCR及western blot的结果显示过表达LncRNA-TUG1增加了SIRT1的mRNA及蛋白水平；D-F：qRT-PCR及western blot的结果显示过表达miR-132-3p降低了SIRT1的mRNA及蛋白水平。与转染pcDNA3.1空质粒和All star阴性转染对照相比较，aP < 0.05 图 3 LncRNA-TUG1可以通过miR-132-3p调控SIRT1的表达 Fig 3 LncRNA-TUG1 regulated the expression of SIRT1 through miR-132-3p in HIEC-6 cells |
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| A-B：双荧光素酶分析提示miR-132-3p与lncRNA-TUG之间能够互补结合并能靶向结合SIRT1 mRNA的3’UTR；C：CCK-8分析显示过表达miR-132-3p或者敲减SIRT1会抵消LncRNA-TUG减轻LPS诱导HIEC-6增殖抑制的作用；D：流式细胞分析提示过表达miR-132-3p或者敲减SIRT1会抵消lncRNA-TUG减轻LPS诱导HIEC-6凋亡的作用。与All star或者transfection NC mix处理组相比较，aP < 0.05；transfection NC mix为pcDNA3.1与All star组成的转染混合物；siRNA-SIRT1 mix为siRNA-SIRT1的混合物 图 4 LncRNA-TUG1能够作为ceRNA对miR-132-3p/SIRT1调控从而发挥保护作用 Fig 4 lncRNA-TUG1 performed a protective role by regulating miR-132-3p/SIRT1 as a ceRNA |
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lncRNA可能成为脓毒症患者多器官功能综合障碍治疗的新靶点以及诊断及病情监测指标。Wang等[8]发现LncRNA-NEAT1在LPS诱导的脓毒症心肌损伤小鼠模型中是降低的，而补充LncRNA-NEAT1可以有效减轻脓毒症小鼠心肌损伤。Jiang等[9]的研究指出LncRNA-HOTAIR可以通过miR-34a/Bcl-2 s通路减轻脓毒症大鼠的急性肾损伤。Xu等[10]报道了脓毒症患者血浆LncRNA-ZNFX1水平的诊断价值，提示LncRNA-ZNFX1可以反映患者的不良预后。本研究发现LPS可以造成小肠上皮细胞中的LncRNA-TUG1降低。LncRNA-TUG1可作为ceRNA调控miR-132-3p/SIRT从而参与小肠上皮细胞的增殖和凋亡，该机制参与LPS诱导的小肠上皮细胞损伤。
本研究利用全转录组RNA测序技术鉴定了LPS处理后的人小肠上皮细胞中的lncRNA、microRNA及mRNA变化。这些存在LPS处理后存在差异表达的lncRNA、microRNA及mRNA可能与脓毒症诱导的小肠上皮细胞损伤有关。在众多存在差异表达的候选基因中，本研究选择了LncRNA-TUG1作为研究对象，因为既往已有研究报道了LncRNA-TUG1在脓毒症造成器官损伤中的作用和机制。比如Hong等[6]发现LPS诱导的大鼠急性肾损伤过程中存在LncRNA-TUG1的下调，其通过miR-142-3p/SIRT1轴参与肾系膜细胞的凋亡和自噬。LncRNA-TUG1还可通过调控miR-34b-5p/GAB1通路减轻脓毒症急性肺损伤[11]。Dong等[12]的研究发现LncRNA-TUG1在血管内皮细胞中可以抑制LPS诱导的细胞凋亡及自噬，还能减轻炎性反应。这些证据说明LncRNA-TUG1很可能也在脓毒症引起小肠上皮细胞损伤中扮演角色。RNA测序和qRT-PCR验证均证实LPS处理可以诱导HIEC-6中的LncRNA-TUG1出现低表达。体外细胞实现发现敲低LncRNA-TUG1可诱导HIEC-6的增殖抑制并促进凋亡，而过表达LncRNA-TUG1则可以减轻LPS引起的细胞损伤。因此笔者认为LSP导致的LncRNA-TUG1缺乏是小肠发生损伤的因素之一，而补充LncRNA-TUG1可能减轻这种损伤。本研究发现的miR-132-3p/SIRT1通路与上述已被报道的miR-142-3p/SIRT1及miR-34b-5p/GAB1通路无上下游关系，彼此是完全平行独立的通路。相信LncRNA-TUG1还可以通过其他microRNA/mRNA通路发挥作用。未来研究中值得找到更多受LncRNA-TUG1调控的microRNA/mRNA通路，这有利于更深入理解LncRNA-TUG1在脓毒症造成器官损伤中的作用和机制。
本研究试图从ceRNA理论的角度入手，即从“LncRNA-microRNA-mRNA”调控的模式对LncRNA-TUG1的功能加以解释。本研究选择了SIRT1作为可能参与LPS诱导HIEC-6损伤的兴趣mRNA。因为RNA测序数据提示SIRT1的mRNA水平在LPS处理的HIEC-6显著降低。SIRT1全称为沉默信息调节因子-2同源蛋白-1（silent mating type information regulation 2 homoloh-1，SIRT1）是一种重要的依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶，具有维持基因组稳定、修复DNA损伤、调控有丝分裂、抗氧化应激、抗炎性反应以及抗凋亡的作用，因此被认为具有细胞保护作用[13-14]。因为氧化应激、失控的炎性反应及凋亡是脓毒症中器官损伤的重要病理生理学因素，故SIRT1可能在脓毒症的发生发展中扮演重要角色[15]。已经有研究利用脓毒症动物模型发现，在脓毒症发生时肝、肺、脾脏及小肠组织中的SIRT1水平降低，而提高SIRT1水平后，脓毒症预后随之改善[16]。本研究在体外试验中证实SIRT1水平的确参与LPS诱导的HIEC-6损伤。接下来，笔者尝试找到介导LncRNA-TUG1调控SIRT1的microRNA，通过生物信息学分析，发现了5个microRNA可能与SIRT1的3端非翻译区结合；也存在与LncRNA-TUG1互补结合序列，同时也在LPS处理的HIEC-6细胞中存在显著高表达。本研究选择了变化最为显著的miR-132-3p作为研究对象。LncRNA-TUG1/miR-132-3p/SIRT1之间的ceRNA调控关系在体外被验证。肿瘤相关的研究提示miR-132-3p具有抑制细胞增殖促进凋亡的作用[17-18]。有研究指出LncRNA-TUG1/miR-132-3p轴具有促进骨肉瘤细胞增殖并抑制凋亡的作用[19]。在本研究中，上调miR-132-3p促进了HIEC-6的凋亡和增殖抑制，下调miR-132-3p可以减轻LPS造成的HIEC-6损伤。因此笔者认为LncRNA-TUG1/miR-132-3p可以减轻LPS引起的HIEC-6损伤。矛盾的是，另一项研究指出LncRNA-TUG1/miR-132-3p可能引起心肌细胞的缺血损伤[20]。这说明在不同的组织和不同的致病因素下LncRNA-TUG1/miR-132-3p轴的功能可能是不一样的。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。
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