急性肺损伤（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）导致的呼吸衰竭以及炎症反应在临床上仍然是危及患者生命的重要因素。目前，全球每年大约有300万ARDS患者，占重症监护病房的10%^[1]。临床上，由脓毒症引起的ARDS的组织损伤最重，病死率最高。而且，脓毒症也是ICU获得性感染的危险因素之一，这进一步加重了疾病的复杂性和患者的经济负担^[2-3]。目前尚未发现对ARDS治疗有效的特效药物^[4]。炎症反应在ALI/ARDS的发病机制和修复中起到重要作用。目前研究认为，脓毒症时白介素-1β（interleukin, IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）等炎症因子的过度释放，以及由此引发的上游Bcl-2基因家族的Bax、Bcl-2蛋白介导的，caspase-3作为执行蛋白的细胞凋亡会破坏肺泡上皮细胞，影响肺泡完整性。因此，抑制炎症反应，促进上皮细胞结构和功能的正常修复，可能是肺损伤恢复的决定性因素^[5-6]。

线性B螺旋表面肽（helix B surface peptide, HBSP）来源于促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）中非促红细胞生成作用的B组螺旋表面疏水段, 已证实它具有显著的组织保护作用^[7]。笔者所在课题组通过采取环化策略提高HBSP稳定性，合成了硫醚环化B螺旋肽（thioether-cyclized helix B peptide, CHBP）^[8]。目前，已经在小鼠肾脏缺血-再灌注损伤模型中证实，CHBP可以保护肾功能，减轻组织炎性反应和细胞凋亡^[9]。本研究拟探讨CHBP在小鼠脓毒症导致的ALI模型中保护作用及其潜在机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物

30只6~8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有涉及动物的实验方案均通过复旦大学动物伦理委员会审批通过。小鼠饲养在没有潜在感染或条件致病的环境下，12 h暗/光周期循环，并可自由饮水进食。

1.2 主要材料与试剂

小鼠肺上皮细胞系MLE-12细胞由复旦大学附属中山医院呼吸科赠送；DMEM高糖培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；大肠杆菌脂多糖（血清型055:B5）购自美国Sigma公司。CHBP由中国科学院上海药物研究所提供。IL-6、IL-1β、TNF-α的ELISA酶联免疫吸附试剂盒购自上海联科生物公司。免疫组化caspase-3抗体购自英国Abcam公司。一步法原位末端标记法（TUNEL）凋亡检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。Bax、Bcl-2、caspase-3的一抗和内参抗体购自德国CST公司。

1.3 ALI造模

实验小鼠采用随机数字表法分成3组（每组10只）：脓毒症致ALI组小鼠静脉注射LPS 5 mg/kg^[10-11]，空白对照组注射等量生理盐水，在脓毒症诱导24 h前，CHBP处理组小鼠腹腔注射10 nmol/kg剂量CHBP。造模18 h后，所有小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，取右肺组织固定于4%多聚甲醛溶液中48 h，行石蜡包埋。

1.4 肺组织荧光TUNEL检测

小鼠肺组织石蜡切片脱蜡至水化，环保透明剂，梯度酒精（无水、95%、75%）浸洗后，用蒸馏水冲洗一次。室温滴加TU破膜液（0.1%TritonX-100，0.1%柠檬酸钠），通透8 min。TBS洗3次后，严格按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书的步骤进行操作。

1.5 免疫组化法检测肺组织caspase-3阳性表达

小鼠肺组织石蜡切片脱蜡至水化，二甲苯、梯度酒精浸洗5 min，TBS冲洗3次，加入pH 9.0的EDTA缓冲液修复抗原，3%双氧水浸泡20 min后，加入caspase-3一抗（1∶8 000）孵育过夜，二抗孵育，3，3’- 二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，双蒸水冲洗后，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察各组肺组织caspase-3阳性表达情况。

1.6 细胞培养

小鼠肺上皮细胞系MLE-12细胞用含10% FBS的DMEM高糖培养基在37℃、CO₂体积分数为5%的培养箱中培养，待细胞传代稳定，取处于对数生长期的细胞进行实验。将MLE-12细胞接种于六孔板，待其贴壁后，应用含100 nmol/mL LPS的无血清培养基培养24 h。空白对照组不作任何处理，CHBP组在LPS处理前1 h用10 nmol/L CHBP预处理。

1.7 细胞上清液ELISA检测

收集处理后的各组细胞上清液至清洁离心管中，4℃、1 000 r/min、10 min离心后，小心收集上清液。使用酶联免疫吸附测定试剂盒检测上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达。实验操作严格按照试剂盒说明书上的步骤进行。

1.8 细胞荧光TUNEL检测

MLE-12细胞建模成功后，吸除培养基，用PBS清洗两遍去除残余培养基，加入新的PBS。根据说明书配置TUNEL检测液，加到每组细胞中，室温孵育5 min后于荧光显微镜下观察。

1.9 Western blot检测

细胞经过处理后，使用PBS冲洗两次，胰酶消化，小心收集各组细胞。使用上海碧云天生物技术有限公司的蛋白抽提试剂盒提取各组细胞的蛋白。Western blot的实验操作步骤参照文献[12]进行。使用ImageJ软件量化分析caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。

1.10 统计学方法

使用Graphpad prism 7软件对数据进行统计分析。所有实验均独立重复三次，计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CHBP预处理可以抑制ALI小鼠肺组织细胞凋亡

建模后18 h观察到，LPS组小鼠活动明显减少，状态萎靡，体温低，毛色差，呼吸声大，肺组织水肿，出血渗出较多，镜下可见大量肺泡壁被破坏并伴有细胞浸润，提示ALI建模成功。肺组织免疫荧光TUNEL检测显示，与对照组（2.67±1.20）个/mm²相比，LPS组小鼠肺组织凋亡细胞数量（39.46±4.51）个/mm²升高（P < 0.01）；CHBP处理组的肺组织凋亡细胞数量（22±2）个/mm²相较LPS组有下降（P=0.001），见图 1。

2.2 CHBP预处理可以减少ALI小鼠肺组织caspase-3阳性细胞数量

肺组织免疫组织化学染色表明，LPS组小鼠肺组织活化caspase-3阳性细胞数量（52.87±3.76）个/mm²较对照组（8.68±1.45）个/mm²增多（P=0.018），多数caspase-3阳性细胞呈核固缩态，形态上提示细胞呈现凋亡特征；CHBP预处理组小鼠肺组织的caspase-3阳性细胞密度（28.67±5.29）个/mm²较LPS组下降（P=0.030），提示CHBP可抑制ALI小鼠肺组织凋亡，见图 2。

2.3 CHBP预处理可以减轻MLE-12细胞上清液炎症因子浓度

本研究结果提示，LPS组MLE-12细胞上清液中，炎症因子IL-1β（100.70±7.61）pg/mL、IL-6（123.10±15.71）pg/mL、TNF-α（138.50±13.12）pg/mL的水平较对照组升高（P < 0.01）。而相较于LPS组，CHBP预处理组炎症因子IL-1β（67.11±3.39）pg/mL、IL-6（70.64±5.59）pg/mL、TNF-α（76.98±7.97）pg/mL表达水平明显降低（P < 0.05），见图 3。

2.4 CHBP预处理可以抑制MLE-12凋亡

体外免疫荧光TUNEL检测提示，与对照组（2.33±0.88）%相比，LPS组MLE-12细胞凋亡比例（45.00±2.88）%增加（P < 0.01），在经过10 nmol/L的CHBP预处理后，MLE-12细胞凋亡比例（30.33±1.86）%下降（P=0.005 5）。

体外Western blot结果显示，CHBP预处理组细胞活化的caspase-3蛋白表达量（0.085±0.063）较LPS组（1.20±0.058）降低（P < 0.01）。另外本研究发现，CHBP预处理后，与下游caspase-3激活相关的Bax蛋白表达下降，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达升高，并且Bax/Bcl-2比值降低差异有统计学意义[CHBP预处理组（2.15±0.13）vs LPS组（3.26±0.10），P < 0.01]，见图 4。

3 讨论

脓毒症是临床上常见的急危重症，会导致系统性的器官功能障碍和对感染的异常免疫反应^[13]。约75%的脓毒症和脓毒症休克的患者会出现不同程度的肺损伤，表现为低氧血症以及无法用心力衰竭解释的肺水肿。有研究显示，重度肺损伤（PaO₂/FiO₂ < 100 mmHg）（1 mmHg=0.133 kPa）在重症监护室（ICU）的患病率为10%，占机械通气患者的1/4，病死率更是高达40%^[14]。脓毒症致ALI发病机制复杂。脓毒症时机体可过度产生炎症因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等，这些炎症因子会激活肺内巨噬细胞以及中性粒细胞破坏肺上皮细胞，启动肺内炎症级联反应，破坏肺泡完整性，增大血管通透性，加重肺损伤^[15]。

近年来的研究发现，在缺氧和炎症浸润的器官或组织中，EPO有旁分泌或自分泌的激素特征，同时与EPO发挥组织保护作用相关的β共受体的表达也相应升高^[16]。这提示着EPO作为内源性的分子肽在治疗炎症方面有着一定的可行性。基于以上研究，Heitrich等^[17]发现，EPO可以通过提高肺组织EPO受体表达从而缓解小鼠脓毒症导致的ALI。然而到目前为止，过量EPO带来的不良反应使得其在临床治疗肺损伤中仍受到限制。CHBP仅保留了EPO的组织保护作用，并且具有较为稳定的化学性质。本研究试图通过探究CHBP在脓毒症致ALI中的保护作用，为临床治疗ALI提供新的思路和方法。

为了揭示CHBP对ALI小鼠的肺保护作用，本研究首先对肺组织进行了TUNEL免疫荧光检测。与LPS模型组相比，CHBP处理组TUNEL阳性细胞数量明显降低，提示肺组织凋亡减轻，损伤减少。半胱天冬酶caspase家族在凋亡的起始和效应阶段发挥重要作用，该通路下游的caspase-3尤为重要，一旦被上游信号激活，直接介导细胞凋亡。Caspase-3是IL-1β转化酶家族成员之一，在整个凋亡进程中占据重要地位，有着“死亡执行蛋白酶”的称号，是细胞多种凋亡途径的共同下游效应部分^[18-19]。本研究发现，LPS模型组caspase-3免疫组化阳性细胞数量明显升高，细胞核多呈固缩状态，提示肺组织细胞发生凋亡，而CHBP预处理可以显著降低caspase-3阳性细胞数量。

本研究选取小鼠MLE-12细胞系，通过LPS刺激模拟体内的肺损伤环境。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子在ALI早期的炎症免疫反应级联放大机制中扮演重要角色。它们作为联系炎症细胞的重要介质激活核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）等信号通路，促使CXC趋化因子、细胞间黏附因子-1、前列腺素E、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IL-8等细胞因子的基因转录及表达，诱导炎症细胞聚集和活化，引发后续肺组织损伤加重^[20]。本研究细胞上清液ELISA结果提示，CHBP预处理组的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平较LPS组明显降低；同时体外免疫荧光TUNEL检测结果表明CHBP预处理可以显著减少MLE-12细胞凋亡比例。以上结果提示了CHBP预处理可以减轻小鼠肺上皮细胞的炎症反应，抑制细胞凋亡，对保持肺泡形态的完整性，抑制炎性渗出有一定的积极作用。Caspase-3作为细胞凋亡的最终执行者，其激活很大程度上依赖细胞色素c的释放。而Bcl-2基因家族的Bax、Bcl-2蛋白的表达水平以及两者的比例是调控线粒体膜的通透性和细胞色素c的释放关键因素^[21]。本研究Western blot结果显示，CHBP可以通过降低Bax/Bcl-2比值，抑制细胞内线粒体膜破坏，抑制caspase-3的级联反应，进而减少细胞凋亡。

然而，本实验也存在一些局限性。受制于研究成本，本研究并未设置CHBP的浓度梯度，因此无法探究CHBP与ALI之间的量效关系。其次，本实验未设置药物对照，这也一定程度影响了实验结果的说服力和实用性。最后，CHBP抑制肺上皮细胞炎症反应以及减少细胞凋亡背后的深层分子机制仍需进一步探究。

综上所述，本研究认为，CHBP可以减轻小鼠脓毒症致ALI的炎症浸润，其作用机制可能与抑制炎症因子产生、提高Bcl-2/Bax蛋白比值抑制线粒体应激、下调caspase-3蛋白表达对抗凋亡有关。本研究为ALI的治疗提供了一种新的方法，但CHBP对脓毒症导致ALI的具体保护机制有待进一步探讨。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突