重症急性胰腺炎为临床常见急腹症，病情凶险，预后差，病死率高^[1]。肺脏是重症急性胰腺炎发生后最早受侵害的脏器之一，但其发病机制至今尚未完全清楚，且缺少有效的治疗方法，因此是研究的热点^[2]。由于过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPAR-γ)具有广泛而强大的抗炎作用^[3]，因此其激动剂可能被应用于急性胰腺炎的治疗，而作为糖尿病常用治疗用药的吡格列酮对PPAR-γ的活化作用显著，除具有胰岛素增敏的作用外，还可有效调节机体炎症水平、减轻内皮细胞损伤程度^[4]，因此具有治疗重症急性胰腺炎肺损伤的潜在价值，然而，其作用效果和机制尚未完全明确，本研究对此进行探讨，并报道如下。

西安交通大学动物实验中心提供健康雄性SD大鼠(SCXK(陕)2018-001)30只，体质量200~300 g/只。随机(随机数字法)分为假手术组、模型组、吡格列酮组，每组10只。血清淀粉酶检测试剂盒购于美国Sigma公司; 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒购于北京中杉金桥生物有限公司; 一氧化氮(NO)检测试剂盒购于美国eBscience公司。本研究获西安交通大学实验动物管理委员会伦理批准(XJTULAC2019-1150)。

30只大鼠自由进水，禁食12 h。假手术组: 大鼠经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，胰胆管逆行注射等体积生理盐水。模型组: 按照课题组既往方法^[5]，大鼠经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，胰胆管逆行注射4%牛磺胆酸钠(美国Sigma公司生产，剂量为1 mL/kg，注射速度0.1 mL/min)，肉眼可见胰腺充血、水肿时提示重症急性胰腺炎造模成功，随后采用Osman肺脏组织学评分标准^[6]相关标准验证重症急性胰腺炎肺损伤。吡格列酮组: 造模前1 h，参考文献^[7]的方法，腹腔注射10%吡格列酮(杭州中美华东制药有限公司生产，批准文号H20050500，剂量为50 mg/kg)。术后，所有大鼠均于双侧后肢皮下注射生理盐水各10 mL/kg，禁食不禁水。术后12 h，每组随机(随机数字法)选6只大鼠进行剖杀，留取肺组织及静脉血。

大鼠暴露胸腔，剪开右心耳收集血液。结扎右肺门，取右肺下叶进行肺组织匀浆、荧光定量PCR，取右肺上叶进行肺组织病理损伤评分。使用12号针头自制肺泡灌洗针，磷酸盐缓冲液进行左侧支气管肺泡灌洗(每次注入3 mL，反复抽吸3次，共注入3次)，收集肺泡灌洗液。

采用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶水平。右肺下叶肺组织经生理盐水清洗后，滤纸吸干，取50 mg，匀浆器制成10%肺组织匀浆，3 000 r/min离心后，采集上清液，采用酶联免疫吸附试验检测TNF-α水平，采用硝酸还原酶法检测NO水平。

右肺下叶肺组织50 mg，采用Trizol法进行细胞总RNA的提取，应用荧光实时定量(RT-PCR)分析扩增产物。Toll样受体2 (TLR2)mRNA、Toll样受体4 (TLR4) mRNA及内参β-actin引物序列见表 1。扩增片段为150 b，反应条件为94℃预变性(7 min)→94℃变性(30 s)→60℃退火(30 s)→72℃延伸(1 min)。2^-△△CT法计算相对表达量。实验重复3次。

各组大鼠右肺上叶肺组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后，切片(厚度4 μm)，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，苏木精染色5 min，1%盐酸酒精分化(30 s)，自来水冲洗后，经碳酸锂返蓝(10 s)，自来水冲洗后经伊红复染，术后脱水和透明，中性树脂封片。每个标本随机选取5张切片，每个切片随机选取5个视野，光学显微镜下观察肺组织病理学变化，采用Osman肺脏组织学评分标准^[6]，将肺组织的病理状态分为水肿、肺泡组织炎性细胞浸润、组织出血等，每个状态的病理改变分为4级，分别评分0~3分，总分即肺组织病理损伤评分，分数越高表明肺脏病理损伤程度越严重。

采用考马斯亮蓝法(Bradford)^[8]测定肺泡灌洗液蛋白含量及血浆蛋白含量，计算肺渗漏指数=肺泡灌洗液蛋白含量/血浆蛋白含量^[9-10]。

应用SPSS 21.0统计学软件进行实验数据的统计和分析。用均数±标准差(Mean±SD)表示正态计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验; 用M(Q_L, Q_U)表示非正态计量资料，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。正态分布资料相关性分析采用Pearson相关性分析，非正态则采用Spearman相关性分析为差异具有统计学意义，以P < 0.05。

3组间血清淀粉酶及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平均差异有统计学意义(P < 0.05);模型组血清淀粉酶及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平均显著高于假手术组，吡格列酮组血清淀粉酶及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平均显著低于模型组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。

3组间肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA相对表达量差异有统计学意义(P < 0.05);模型组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA相对表达量均显著高于假手术组，吡格列酮组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA相对表达量均显著低于模型组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。

3组间肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数均差异有统计学意义(P < 0.05);模型组肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数均显著高于假手术组，吡格列酮组肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数均显著低于模型组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。

Spearman相关性分析结果显示，肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA相对表达量与肺组织病理损伤评分均呈显著正相关关系(P < 0.05);Pearson相关性分析结果显示，肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA相对表达量与肺渗漏指数均呈显著正相关关系(P < 0.05)。见表 5，图 1。

A: TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与肺组织病理损伤评分的相关性; B: TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与肺渗漏指数的相关性 图 1 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA与肺组织病理损伤评分及肺渗漏指数的相关性 Fig 1 Correlation between TLR2 mRNA, TLR4 mRNA and lung pathological injury score and lung leakage index

图选项

20%以上的急性胰腺炎可发展为重症急性胰腺炎伴多器官功能衰竭，病死率可达5%~10%^[11]，而肺损伤是最常见并发症之一^[12]。在本研究中，经胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠后，模型组大鼠肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数及淀粉酶均高于假手术组，提示重症急性胰腺炎肺损伤模型构建成功。

重症急性胰腺炎相关的多器官损伤与多种细胞因子参与的炎症介质网络显著相关。有研究发现，急性胰腺炎发生早期，血清中TNF-α和白介素-6(IL-6)等炎症因子显著升高，其升高水平与胰腺炎的严重程度呈正相关^[13]。另外，胰蛋白酶、淀粉酶等胰酶也是急性胰腺炎发生时直接破坏肺部血管、肺泡膜而致肺损伤的重要物质^[14]; NO作为内源性舒张因子，具有显著的扩张血管作用^[15]，在胰腺炎发生时可导致胰腺微循环障碍、胰腺水肿加重，并且肺巨噬细胞中NO水平增加所致氧活性中间产物聚集可进一步导致并加重肺损伤^[16-17]。在本研究中，模型组肺组织匀浆中的TNF-α、NO水平均显著高于假手术组，证实TNF-α、NO等参与了重症急性胰腺炎肺损伤的发展过程。因此，降低TNF-α等炎症因子的水平，减少胰酶释放及NO生成，可能发挥治疗重症急性胰腺炎肺损伤的作用。

在重症急性胰腺炎肺损伤的发生、发展过程中，Toll样受体家族(TLRs)具有重要的作用^[18]。其中，TLR2和TLR4是参与炎症信号向细胞内转导的重要受体，不仅可激活NF-κB信号通路，导致促炎细胞因子TNF-α、IL-6等分泌增加，而且还可激活一氧化氮合酶，促使大量NO生成，进而诱发严重的炎症反应和氧化损伤以及微循环障碍，致使急性胰腺炎进展并伴发其他器官损伤^[19-21]。本研究中，模型组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平均显著高于假手术组，提示肺组织中TLR2、TLR4可能参与了急性胰腺炎所致肺损伤的发生、发展过程。在前期研究中也已证实，肺组织中的TLR4/NF-κB信号通路不仅在急性胰腺炎全身炎症反应过程中具有促进作用，并且还参与了肺损伤的发展过程^[22]，对TLR4/NF-κB信号通路进行干预，可能改善重症胰腺炎所致肺损伤的程度^{[5, 23]}; 另外也有研究发现，小鼠被敲除TLR2和TLR4基因后，其急性胰腺炎的炎症程度明显减轻，肺损伤的程度也降低^[24]。以上均提示，对TLR2和TLR4进行调控，可能实现重症急性胰腺炎肺损伤的治疗目的。

由于吡格列酮作为噻唑烷二酮类药物，可高选择性的激动PPAR-γ^[25]，因此具有降低体内NO合成、调节TNF-α水平并减少内皮细胞凋亡的作用^[26]，所以可以用于调控重症胰腺炎NF-κB信号通路^[27]、改善炎症反应失衡状态和胰腺损伤程度，并且可能用于重症急性胰腺炎的治疗^[28]，但其对重症急性胰腺炎肺损伤的治疗效果尚不明确，相关研究较少因此具体机制不详。本研究中吡格列酮组大鼠血清淀粉酶及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平均显著低于模型组，且肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数也显著低于模型组，提示吡格列酮可改善肺组织炎症水平、降低肺巨噬细胞NO合成，进而减轻重症急性胰腺炎所致肺损伤程度、改善肺血管渗漏状态。给予吡格列酮后，大鼠肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平较模型组显著下降，大鼠肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA相对表达量与其肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数均呈显著正相关关系，提示吡格列酮可能是通过抑制肺组织中TLR2和TLR4的转录进而减少TNF-α、NO表达，从而实现减轻重症急性胰腺炎肺损伤的目的。然而，吡格列酮改善重症急性胰腺炎炎症反应失衡状态和胰腺损伤程度的作用，是否与抑制肺组织中TLR2和TLR4转录及表达进而调控NF-κB信号通路有关，有待进一步深入研究。

利益冲突   所有作者均声明不存在利益冲突