2021, Vol. 30
雨蛙素、RPMI 1640细胞培养液、胎牛血清购于美国Sigma公司；淀粉酶、TNF-α、IL-1、IL-6的ELISA试剂盒购于美国Gibco公司；miR-494的RT-PCR检测试剂盒购于美国Thermo Fisher公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡检测试剂盒购于美国BD Bioscience公司；Western Blot检测所用抗体及相关试剂盒均购于美国Bioworld公司。细胞培养箱、酶标仪为美国Thermo公司生产；流式细胞仪为美国BD Bioscience公司生产；电泳仪、电转仪均为美国Bio-Rad公司生产。大鼠胰腺腺泡细胞AR42J购于美国American Type Culture Collection公司。
1.2 研究方法 1.2.1 AR42J细胞的培养将AR42J细胞半贴壁培养于细胞培养瓶中，加入RPMI 1640细胞培养液（含10% 胎牛血清），于37 ℃、5%二氧化碳条件下培养。每48 h更换新的培养液。细胞分瓶时使用1 mL移液器轻轻吹下，置于1.5 mL EP管中，室温下800转/min离心5 min，获取细胞及上清液。
1.2.2 急性胰腺炎细胞模型构建及验证构建模型前24 h，参考文献[5]的方法，将AR42J细胞调整浓度为1×106/mL并种植于6孔板中，RPMI 1640细胞培养液培养24 h。将AR42J细胞设为对照组与模型组。对照组不予雨蛙素处理。模型组加入10 nmol/L雨蛙素，震荡混匀。随后收集对照组及模型组经雨蛙素处理0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后的细胞培养上清液，应用ELISA法检测对照组及模型组各时间点的细胞培养上清液中的淀粉酶、TNF-α、IL-1、IL-6水平，验证急性胰腺炎细胞模型的造模情况。每组6复孔，随后根据淀粉酶、TNF-α、IL-1、IL-6检测情况确定最佳造模时间。
1.2.3 RT-PCR检测AR42J细胞中miR-494表达水平采用RT-PCR法检测对照组及模型组0 h、4 h、8 h、12 h、24 h各组细胞中miR-494表达水平。首先，采用Trizol法抽提细胞总RNA。逆转录反应条件为：16℃（30 min）→42℃（30 min）→85℃（5 min）→4℃（维持）。聚合酶链式反应扩增条件为：酶激活95℃（10 min，循环1次）；扩增95℃（15 s）→60℃（60 s）循环40次。检测次数为3次。RT-PCR结果采用2-ΔΔCt表示：2-ΔΔCt =X（相对表达倍数），ΔΔCt=ΔE –ΔC，ΔE=Ct实验组-Ctβ-actin，ΔC=Ct对照组-Ctβ-actin。
1.2.4 miR-494转染转染前24 h将AR42J细胞调整浓度为1×106/mL并种植于6孔板中，分别设为对照组、阴性对照组和miR-494转染组，每组6复孔。应用无血清RPMI 1640细胞培养液分别稀释Lipo 2000转染试剂、Lipo 2000转染试剂+阴性对照miRNA（100 nmol/L）和Lipo 2000转染试剂+miR-494 mimics（100 nmol/L），室温静置25 min并将细胞培养液吸净后，分别加入对照组、阴性对照组和miR-494转染组细胞中，随后于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养6 h。吸出转染试剂后，于RPMI 1640细胞培养液继续培养48 h后，RT-PCR检测miR-494表达水平以验证miR-494转染效率，随后将阴性对照组和miR-494转染组细胞按照1.2.2部分构建急性胰腺炎细胞模型。模型构建后8 h，收集各组细胞，采用流式细胞计数法检测细胞凋亡情况，采用Western Blot法检测各组细胞中的ROCK1、PTEN蛋白表达水平。
1.3 统计学方法采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。正态计量资料用均数±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；假设检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 急性胰腺炎细胞模型验证雨蛙素处理AR42J细胞后，细胞培养上清液中淀粉酶、TNF-α、IL-1、IL-6水平逐渐升高，8 h时达到高峰，且显著高于对照组（P < 0.05），提示急性胰腺炎细胞模型构建成功；上述指标与其他时间组比较差异均有统计学意义（P < 0.05），因此选择模型构建后8 h的细胞用于实验。见表 1。
| 组别 | 淀粉酶（U/L） | TNF-α（pg/mL） | IL-1（pg/mL） | IL-6（pg/mL） |
| 对照组 | 16.85±1.30 | 55.68±3.39 | 16.06±0.95 | 59.00±3.25 |
| 模型组 | ||||
| 0 h | 16.82±1.21 | 55.95±3.72 | 16.12±1.16 | 61.28±3.38 |
| 4 h | 17.55±1.12 | 59.83±4.10 | 16.70±1.07 | 70.82±4.13ab |
| 8 h | 30.15±1.63abc | 172.48±12.28abc | 34.58±2.43abc | 96.38±5.95abc |
| 12 h | 22.03±1.43abcd | 72.35±4.42abcd | 27.05±1.77abcd | 76.55±4.58abcd |
| 24 h | 15.37±1.16cde | 62.23±4.03de | 20.28±1.38abcde | 54.90±3.44bcde |
| F值/P值 | 106.287/ < 0.001 | 330.718/ < 0.001 | 142.944/ < 0.001 | 78.185/ < 0.001 |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与模型组0 h比较，bP < 0.05；与模型组4 h比较，cP < 0.05；与模型组8 h比较，dP < 0.05；与模型组12 h比较，eP < 0.05 | ||||
由RT-PCR可见，急性胰腺炎细胞模型构建8 h、12 h、24 h时，miR-494表达水平均显著高于对照组、0 h时及4 h组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
| 组别 | miR-494 |
| 对照组 | 1.01±0.10 |
| 模型组 | |
| 0 h | 1.01±0.10 |
| 4 h | 1.05±0.08 |
| 8 h | 3.54±0.24abc |
| 12 h | 3.37±0.19abc |
| 24 h | 3.29±0.22abcd |
| F值/P值 | 362.571/ < 0.001 |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与模型组0 h比较，bP < 0.05；与模型组4 h比较，cP < 0.05；与模型组8 h比较，dP < 0.05 | |
转染后，miR-494转染组miR-494的表达水平显著高于对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。构建模型后，阴性对照组胰腺腺泡AR42J细胞的凋亡比例显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；miR-494转染组的凋亡比例显著低于阴性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 1、表 3。
|
| 图 1 各组胰腺腺泡细胞凋亡情况 Fig 1 Apoptosis of pancreatic acinar cells in each group |
|
|
| 组别 | miR-494 | 凋亡细胞比例（%） |
| 对照组 | 1.00±0.11 | 5.40±0.82 |
| 阴性对照组 | 1.00±0.11a | 17.67±2.57a |
| miR-494转染组 | 2.07±0.21ab | 10.48±1.80ab |
| F值/P值 | 102.869/ < 0.001 | 64.967/ < 0.001 |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与阴性对照组比较，bP < 0.05 | ||
阴性对照组胰腺腺泡AR42J细胞中，ROCK1、PTEN蛋白的表达水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；miR-494转染组ROCK1、PTEN蛋白的表达水平均显著低于阴性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 2，表 4。
|
| 图 2 Western Blot检测各组胰腺腺泡细胞ROCK1、PTEN蛋白表达 Fig 2 Protein expression of ROCK1 and PTEN detected by Western blot in pancreatic acinar cells |
|
|
| 组别 | ROCK1 | PTEN |
| 对照组 | 0.49±0.05 | 0.27±0.03 |
| 阴性对照组 | 0.92±0.09a | 0.89±0.10a |
| miR-494转染组 | 0.62±0.07ab | 0.56±0.05ab |
| F值/P值 | 54.111/ < 0.001 | 128.018/ < 0.001 |
| 注：与对照组比较，aP < 0.05；与阴性对照组比较，bP < 0.05 | ||
急性胰腺炎是临床发病率和病死率均较高的严重急性炎症性疾病，多种因素均参与其发生发展过程[9]，但具体病理生理学机制尚未完全明确。miR-494在多种疾病的发生及发展过程中均发挥重要的调控作用，一项体外实验结果显示，miR-494在卵巢癌组织中的含量较低，当为卵巢癌肿瘤细胞构建外周高miR-494环境时，肿瘤细胞的增殖及迁移都受到显著的抑制[10]。目前已证实，miR-494的靶基因包括c-Myc基因，通过对该基因进行抑制，能够发挥显著的抗肿瘤作用[11]。另外也有研究发现，miR-494是胰腺癌预后不良的独立预测因子[12]。然而，miR-494与胰腺炎的相关研究尚处于初步阶段，有研究发现，miR-494表达上调可抑制某些促凋亡蛋白表达从而调节胰腺腺泡细胞凋亡[13]，但其在急性胰腺炎中是否发挥调控凋亡的作用以及其分子机制尚不明确。
本研究主要分析了miR-494在急性胰腺炎中的表达变化情况，以及miR-494对胰腺腺泡细胞凋亡的影响。大鼠胰腺腺泡细胞AR42J具有胰腺外分泌特征，培养条件容易掌握，细胞反应性良好，转染效率较高，在胰腺疾病如急性胰腺炎相关机制的研究中被广泛应用于的细胞模型构建[14]。本研究也采用大鼠胰腺腺泡细胞AR42J构建了急性胰腺炎的细胞模型，并通过检测细胞培养上清液中的淀粉酶及相关细胞因子水平进行了模型验证，结果显示，在雨蛙素处理AR42J细胞8 h、12 h时的细胞培养上清液中，淀粉酶、TNF-α、IL-1、IL-6水平均显著升高（P < 0.05）且高于对照组，表明急性胰腺炎细胞模型构建成功，而其中以8 h时显著，因此选择雨蛙素处理后继续培养8 h为后续实验的造模条件。随后，通过对急性胰腺炎细胞模型造模后的miR-494表达水平进行检测，发现其在8 h、12 h、24 h时的表达水平均显著高于对照组及0 h和4 h时（P < 0.05），提示急性胰腺炎发生时，伴随细胞损伤以及炎症因子释放的加剧，miR-494表达情况也逐渐上调，其表达情况可能与急性胰腺炎发生时胰腺腺泡细胞的损伤程度相关。
在急性胰腺炎的发生发展过程中，伴有细胞凋亡和细胞坏死[15]。凋亡属于程序性、生理性的细胞死亡，可伴有细胞的萎缩、破碎、分裂[16]。体外研究也显示，通过下调抗凋亡基因能够促进胰腺腺泡细胞的凋亡，从而降低急性胰腺炎炎症反应程度和组织损伤程度[17-20]。
进一步研究结果显示，阴性对照组胰腺腺泡细胞凋亡比例显著高于对照组（P < 0.05），提示急性胰腺炎发生时，胰腺腺泡细胞的凋亡相关信号通路被激活；而miR-494转染组的细胞凋亡比例显著低于阴性对照组（P < 0.05），提示miR-494能够抑制急性胰腺炎发生时的细胞凋亡。因此可推测，miR-494可能通过抑制胰腺腺泡细胞凋亡，降低凋亡过程在急性胰腺炎中的保护性作用，加重急性胰腺炎胰腺组织炎症及损伤程度，这也与笔者在对造模后miR-494表达情况的观察中得以证实——雨蛙素处理后8 h、12 h的淀粉酶、TNF-α、IL-1、IL-6水平以及miR-494表达水平均显著高于其他时间。
为进一步探索miR-494对胰腺腺泡细胞凋亡的具体分子机制，本研究分析了miR-494对促凋亡蛋白（ROCK1、PTEN）表达的影响，发现miR-494转染组的胰腺腺泡细胞中ROCK1、PTEN蛋白的表达水平均显著低于阴性对照组（P < 0.05），进一步说明miR-494可负向调控ROCK1、PTEN蛋白表达，进而参与对急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡的调控，然而其具体调控机制仍需进一步深入研究。
由于ROCK1作为RhoA/ROCK信号通路的重要组成部分，除胰腺外，其主要分布于肺、肾[21]，因此miR-494是否可能通过该信号通路参与重症急性胰腺炎发生时肺、肾损伤的发展过程有待研究；而ROCK1虽在心肌中分布低于ROCK2，但有研究发现当ROCK1过度激活时，可能导致心肌细胞凋亡增加[21-23]，因此，miR-494是否可用于改善重症急性胰腺炎所致心肌损伤也有研究的价值。而PTEN作为抑癌基因，被发现参与了多种肿瘤的增殖、凋亡、迁移[24]，在胰腺相关领域，则被发现其下调可通过激活PI3K/AKT信号通路导致胰腺癌的发展[25-26]，但对胰腺炎的作用研究较少，目前仅发现可能参与了胰腺炎时胰腺腺泡细胞的自噬与凋亡[27]，因此，miR-494是否通过PTEN/PI3K/AKT途径参与调控胰腺腺泡细胞凋亡甚至自噬，值得研究。
另外，由于TLR4/NF-κB信号通路在胰腺炎发生时，尤其在由细菌脂多糖内毒素（LPS）诱导时的炎症反应及其级联放大过程中有重要作用[28-30]，而有研究发现ROCK及PTEN可能参与该信号通路的调控[31-32]，因此，miR-494是否可能通过前者与TLR4/NF-κB信号通路发生串扰，进而对胰腺炎炎症反应产生影响，有待进一步研究。
综上所述，miR-494在急性胰腺炎细胞模型中的表达显著升高，而过表达的miR-494可能通过抑制促凋亡蛋白的表达抑制胰腺腺泡细胞的凋亡，从而发挥促进急性胰腺炎发生发展的作用，但其具体作用机制仍需进一步深入研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
| [1] | van Dijk SM, Hallensleben NDL, van Santvoort HC, et al. Acute pancreatitis: recent advances through randomised trials[J]. Gut, 2017, 66(11): 2024-2032. DOI:10.1136/gutjnl-2016-313595 |
| [2] | Lee PJ, Papachristou GI. New insights into acute pancreatitis[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2019, 16(8): 479-496. DOI:10.1038/s41575-019-0158-2 |
| [3] | Yang Y, Huang Q, Luo C, et al. MicroRNAs in acute pancreatitis: From pathogenesis to novel diagnosis and therapy[J]. J Cell Physiol, 2020, 235(3): 1948-1961. DOI:10.1002/jcp.29212 |
| [4] | Miao B, Qi WJ, Zhang SW, et al. miR-148a suppresses autophagy by down-regulation of IL-6/STAT3 signaling in cerulein-induced acute pancreatitis[J]. Pancreatology, 2019, 19(4): 557-565. DOI:10.1016/j.pan.2019.04.014 |
| [5] | 唐曦平, 张露艺, 梁志海, 等. 基因芯片筛选ghrelin miRNA转染胰腺炎细胞模型后的差异表达基因[J]. 胃肠病学, 2020, 25: 96-100. DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2020.02.006 |
| [6] | 韩永艳, 王春耀, 杨林, 等. 微小RNA-216a、324-5p、29a在急性胰腺炎患者外周血中的表达及其与并发肝损伤的相关性[J]. 中华医学杂志, 2020, 100(27): 2126-2131. DOI:10.3760/cma.j.cn112137-20200103-00016 |
| [7] | 孙涛. 急性胰腺炎血浆miRNAs表达及miR-494调节胰腺腺泡细胞凋亡的机制研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2016. |
| [8] | Zhang KK, Yu SS, Li GY, et al. miR-135a deficiency inhibits the AR42J cells damage in cerulein-induced acute pancreatitis through targeting FAM129A[J]. Pflügers Arch Eur J Physiol, 2019, 471(11/12): 1519-1527. DOI:10.1007/s00424-019-02329-5 |
| [9] | Ortiz Morales CM, Girela Baena EL, Olalla Muñoz JR, et al. Radiology of acute pancreatitis today: the Atlanta classification and the current role of imaging in its diagnosis and treatment[J]. Radiologia (Engl Ed), 2019, 61(6): 453-466. DOI:10.1016/j.rx.2019.04.001 |
| [10] | Zhao X, Zhou Y, Chen YU, et al. miR-494 inhibits ovarian cancer cell proliferation and promotes apoptosis by targeting FGFR2[J]. Oncol Lett, 2016, 11(6): 4245-4251. DOI:10.3892/ol.2016.4527 |
| [11] | Zhang RT, Shi HR, Ren F, et al. MicroRNA-338-3p suppresses ovarian cancer cells growth and metastasis: implication of Wnt/catenin beta and MEK/ERK signaling pathways[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2019, 38(1): 1-13. DOI:10.1186/s13046-019-1494-3 |
| [12] | Ma Y, Li G, Hu J, et al. MicroRNA-494 regulates Gli3 expression and inhibits pancreatic cancer cells growth and migration[J]. J Cell Biochem, 2018, 119(7): 5324-5331. DOI:10.1002/jcb.26658 |
| [13] | Wan BS, Cheng M, Zhang L. Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 promotes cell proliferation via activation of AKT and is directly targeted by microRNA-494 in pancreatic cancer[J]. World J Gastroenterol, 2019, 25(40): 6063-6076. DOI:10.3748/wjg.v25.i40.6063 |
| [14] | Wang YJ, Bu CY, Wu KK, et al. Curcumin protects the pancreas from acute pancreatitis via the mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2019, 20(4): 3027-3034. DOI:10.3892/mmr.2019.10547 |
| [15] | Wang N, Ma J, Ren Y, et al. Secreted klotho from exosomes alleviates inflammation and apoptosis in acute pancreatitis[J]. Am J Transl Res, 2019, 11(6): 3375-3383. |
| [16] | Kong L, Wu QH, Zhao LC, et al. Effect of microRNA-27a-5p on apoptosis and inflammatory response of pancreatic acinar cells in acute pancreatitis by targeting PTEN[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(9): 15844-15850. DOI:10.1002/jcb.28855 |
| [17] | Huang HL, Tang GD, Liang ZH, et al. Role of Wnt/β-catenin pathway agonist SKL2001 in Caerulein-induced acute pancreatitis[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2019, 97(1): 15-22. DOI:10.1139/cjpp-2018-0226 |
| [18] | 薛彬华, 余维丽, 王小蝶, 等. IRF9基因沉默对雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞凋亡的影响[J]. 安徽医科大学学报, 2020, 55(4): 508-512. DOI:10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2020.04.005 |
| [19] | 程璐, 韩树堂. 急性胰腺炎内质网应激反应机制研究进展[J]. 中华胰腺病杂志, 2019, 19(1): 69-72. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2019.01.018 |
| [20] | Zhu Y, Liu S, Wang F. MicroRNA MiR-27a-5p alleviates the cerulein-induced cell apoptosis and inflammatory injury of AR42J cells by targeting Traf3 in acute pancreatitis[J]. Inflammation, 2020, 43(5): 1988-1998. DOI:10.1007/s10753-020-01272-3 |
| [21] | Mishra RK, Alokam R, Sriram D, et al. Potential role of Rho kinase inhibitors in combating diabetes-related complications including diabetic neuropathy: a review[J]. Curr Diabetes Rev, 2013, 9(3): 249-266. DOI:10.2174/1573399811309030006 |
| [22] | Yang X, Li Q, Lin X, et al. Mechanism of fibrotic cardiomyopathy in mice expressing truncated Rho-associated coiled-coil protein kinase 1[J]. FASEB J, 2012, 26(5): 2105-2116. DOI:10.1096/fj.11-201319 |
| [23] | 谢发江, 冯健, 李家富. RhoA/ROCK信号通路在糖尿病心肌病发病机制中的研究进展[J]. 临床心血管病杂志, 2018, 34(9): 846-850. DOI:10.13201/j.issn.1001-1439.2018.09.003 |
| [24] | Li A, Qiu M, Zhou H, et al. PTEN, insulin resistance and cancer[J]. Curr Pharm Des, 2017, 23(25): 3667-3676. DOI:10.2174/1381612823666170704124611 |
| [25] | 孙吉春, 黄飞舟, 聂晚频, 等. MiR-21通过PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制胰腺癌细胞系生长侵袭能力的体外研究[J]. 中国现代医学杂志, 2015, 25(12): 39-44. |
| [26] | 成鉴晓, 江月萍, 任琳琳, 等. lncRNA MEG3通过调控miR-543/PTEN分子轴抑制胰腺癌细胞增殖及转移的机制[J]. 肿瘤防治研究, 2019, 46(7): 588-593. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2019.18.1876 |
| [27] | 赵明一, 陈涛, 吴天鸣. microRNA-181通过靶向PTEN对胰腺泡细胞自噬及凋亡的影响及作用机制研究[J]. 医学分子生物学杂志, 2019, 16(3): 215-223. DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2019.03.000 |
| [28] | Pan LF, Yu L, Wang LM, et al. Augmenter of liver regeneration (ALR) regulates acute pancreatitis via inhibiting HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway[J]. Am J Transl Res, 2018, 10(2): 402-410. |
| [29] | Pan L, Yu L, Wang L, et al. Inflammatory stimuli promote oxidative stress in pancreatic acinar cells via Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway[J]. Int J Mol Med, 2018, 42(6): 3582-3590. DOI:10.3892/ijmm.2018.3906 |
| [30] | 牛泽群, 王立明, 冯辉, 等. TLR4/NF-κB信号通路在急性重症胰腺炎相关肺损伤大鼠中的作用研究[J]. 现代消化及介入诊疗, 2019, 24: 1404-1407. DOI:10.3969/j.issn.1672-2159.2019.12.009 |
| [31] | 郭峰. GEF-H1/RhoA信号途径在调节LPS介导血管内皮细胞IL-6、TNF-α、IL-8和ICAM-1表达中的作用机制[D]. 上海: 上海交通大学, 2012. |
| [32] | 尹华华. PTEN调控LPS活化TLR4信号通路的作用及机制研究[D]. 重庆: 第三军医大学, 2007. |