2021, Vol. 30
尽管对脓毒症的发病机理和治疗策略的理解已取得重大进展，但脓毒症仍是重症监护病房死亡的主要原因[1]。脓毒症诱导的急性肺损伤主要表现为肺微血管通透性的增加、肺水肿和缺氧。失控性炎症反应和肺血管内皮屏障功能障碍是脓毒症急性肺损伤的两个重要病理生理特征[2]。
雌激素相关受体α（ERRα）是最早被辨别的孤儿核受体之一，因其与人类雌激素受体α在DNA结合域上的相似性而被首次识别[3]。大量研究报道称，ERRα是能量代谢的关键转录调节因子，参与葡萄糖和脂质代谢，线粒体生物发生以及各种细胞、组织和器官的代谢适应[4-5]。本课题组前期研究表明，抑制ERRα的表达能够加重脓毒症急性肺损伤模型的炎症反应[6-7]。除了调节炎症反应外，ERRα可能对血管内皮屏障功能具有重要的调控作用。ERRα和PGC-1α协同作用可通过下游靶点去乙酰化酶3（SIRT3）、核呼吸因子1（NRF-1）和核呼吸因子2（NRF-2）调节线粒体相关基因表达（如细胞色素c，ATP合酶β和超氧化物歧化酶）和细胞活性氧（ROS）产生[8]。线粒体ROS的产生不仅可导致内皮细胞凋亡，还可对血管内皮粘附连接和紧密连接蛋白产生影响[9]。本研究拟通过抑制ERRα的表达来探讨ERRα对脂多糖诱导的内皮细胞凋亡及连接蛋白的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料与试剂大鼠肺微血管内皮细胞（RPMVECs）系购买于北京北纳生物，针对大鼠ERRα基因构建的重组慢病毒shERRα购买于武汉锐博生物科技有限公司，DMEM/F12培养基购买于南京吉诺生物，胎牛血清、胰酶和Escherichia coli O26:B6 LPS购买于美国Sigma公司。活性氧红色荧光测定试剂盒购买于上海杰美基因，TUNEL凋亡检测试剂盒购买于南京诺唯赞生物，Annexin V-FITC和PI凋亡检测试剂盒购买于美国BD生物科学，一抗[ERRα、钙黏蛋白（E-Ca）、闭合蛋白（Occludin）、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl2、Smac、细胞色素c）购买于美国Cell Signaling公司，紧密连接蛋白（ZO-1）、连接粘附分子A（JAM-A）、GAPDH购买于英国Abcam公司]，二抗[IRDye® 800CW羊抗兔二抗（1∶15 000稀释）购买于美国LI-COR公司；羊抗兔IgG (Alexa Fluor® 555 Conjugate)购买于美国Cell Signaling公司]。
1.2 细胞处理及分组用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养RPMVEC，并置于37℃含有5% CO2的培养箱中。使用本课题组之前研究构建好的ERRα敲低的稳转细胞株用于实验分组[7]。将约1.5×106个细胞种于六孔板种，用含有血清的完全培养基孵育过夜用于后续实验。将六孔板中的细胞分为4组：正常对照组（Ctr组）；shERRα敲低组（shERRα组）；正常细胞+LPS处理组（LPS组）：六孔板中的细胞用无血清的培养基饥饿培养12 h后，用20 μg/mL LPS处理12 h；shERRα+LPS组：ERRα敲低的细胞按LPS组处理。
1.3 细胞内ROS水平的检测六孔板中四组细胞经过相应处理后，按照试剂盒说明书进行操作。细胞进行ROS染色后半小时内进行细胞流式仪分析，观察藻红蛋白（phycoerythrin，PE）波段，观察50 000个细胞，波峰右移，表明超氧阴离子含量高。
1.4 原位末端缺刻标记法（TUNEL）检测细胞凋亡程度将种植与载玻片上的四组细胞用4%多聚甲醛在4℃固定25 min，用PBS清洗两次，每次5 min，吸干样品周围的液体。用含有0.2% Triton®X-100的PBS孵育玻片5 min进行通透处理，用PBS清洗2次后用滤纸吸干样品周围液体。避光状态下，滴加100 µL 1×平衡缓冲液使其全部覆盖待检样本区域，室温平衡20 min。平衡结束后，用吸水纸吸掉1×平衡缓冲液，然后在样本上滴加50 μL TdT孵育缓冲液，使试剂均匀分布后将载玻片置于湿盒内，37℃孵育60 min。去掉多余液体，用PBS清洗2次，每次5 min。用DAPI在室温状态下染色5 min。PBS清洗后封片于荧光显微镜下观察，凋亡的细胞核产生红色荧光。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡用含0.25% EDTA的胰酶将各组细胞消化下来后，用冷PBS洗涤细胞两次，然后将细胞以1×106细胞/ mL的浓度重悬于1×Binding Buffer中。将100 µL溶液（1×105个细胞）转移到5 mL培养管中，加入5 µL FITC Annexin V，添加10 µl PI，轻轻涡旋细胞，在黑暗中于室温（25℃）孵育15 min，在每个试管中加入400 µL 1×Binding Buffer。在1 h内通过流式细胞仪进行凋亡分析。
1.6 蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测细胞ERRα、Bax、Bcl2、Smac、细胞色素c、ZO-1、E-Ca、Occludin和JAM-A蛋白表达用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（谷歌生物，武汉）裂解四组RPMVECs细胞，使用BCA蛋白质检测试剂盒（碧云天，南京）测定总蛋白质浓度。将等量（40 μg）的蛋白质样品进行8%~12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。然后将凝胶上的蛋白质转移到0.45 μm的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，Merck Millipore，美国）上，在25℃下用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，并与相应一抗在4℃下孵育过夜。与相应二抗（1∶1 000稀释）在室温孵育1 h，TBS-T洗涤3次。采用Odyssey双色红外激光成像系统扫描PVDF膜并成像，以目的蛋白与内参GAPDH条带的灰度值比值作为目的蛋白表达量。
1.7 细胞荧光检测ZO-1表达将细胞种植于载玻片上，待细胞的生长密度达到95%以上后，用4%多聚甲醛固定，PBS洗净，用含有5%胎牛血清（BSA）孵育玻片进行封闭处理30 min，PBS清洗3次，每次5 min，然后与ZO-1抗体在4℃下孵育过夜，将样品与Alexa Fluor 555偶联的二抗（1∶2 000稀释）在25℃孵育1 h。用DAPI进行染核。在激光共聚焦荧光显微镜下观察。
1.8 统计学方法使用SPSS 16.0软件分析数据。所有数据以均数±标准差（Mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 ERRα基因敲低对LPS诱导的细胞内ROS的水平的影响如图 1所示，与Ctr组和shERRα组比较，经过LPS处理后PE藻红蛋白峰发生右移，细胞内ROS水平明显增加（P < 0.01），而shERRα+LPS组细胞内ROS水平更高（P < 0.05），结果表明，抑制ERRα的表达将会促进LPS诱导RPMVECs内ROS的产生。
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| A：流式细胞术测定四组细胞内荧光强度，正常细胞内ROS含量较低，荧光较弱，峰值偏左；ROS阳性细胞胞中荧光明显增强，PE藻红蛋白峰发生右移。B：根据三次实验，定量分析四组细胞内ROS相对荧光强度，与Ctr和shERRα组比较，aP < 0.01；与LPS组比较，bP < 0.05 图 1 ROS荧光检测试剂盒测RPMVECs内ROS的水平 Fig 1 The level of ROS in RPMVECs measured by ROS fluorescence kit |
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如图 2，细胞TUNEL实验结果显示，Ctr组和shERRα组未观察到明显红色荧光，而LPS处理后的RPMVECs观察到有TUNEL阳性细胞（16.44±2.55，P < 0.05），而shERRα+LPS组细胞总数减少，同时TUNEL阳性细胞数比例明显增加（37.45±3.79，P < 0.05）。
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| A：正置荧光显微镜下观察各组细胞玻片，正常细胞核被DAPI染成蓝色，TUNEL阳性细胞胞核染成红色，放大200倍。B：使用Image pro plus软件对TUNEL阳性细胞定量分析与Ctr和shERRα组比较，aP < 0.01；与LPS组比较，bP < 0.05 图 2 TUNEL检测RPMVECs细胞凋亡情况 Fig 2 The apoptosis of RPMVECs detected by TUNEL staining |
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同时，应用AnnexinV-FITC和PI双染法检测四组细胞凋亡百分比，流式细胞术的结果显示（如图 3），Ctr组和shERRα组细胞的凋亡率均在正常水平（4.55±1.07；4.01±0.99），LPS组细胞总的凋亡率（%）有所增加（23.56±2.22，P < 0.05），而shERRα+LPS组细胞总凋亡率（%）明显增加（39.78±4.125，P < 0.01）。
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| A：Annexin-V阳性、PI阴性为早期凋亡细胞，Annexin-V、PI双阳性为晚期凋亡细胞。B：根据三次实验，定量分析四组细胞的总凋亡率。与Ctr和shERRα组比较，aP＜0.01；与LPS组比较，bP0.05 图 3 流式细胞术检测细胞凋亡情况 Fig 3 The cell apoptosis detected by flow cytometry |
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在分子水平，应用Western Blot检测线粒体凋亡相关蛋白的表达，结果显示（如图 4），与对照组相比，在LPS的刺激下，RPMVECs胞内ERRα以及凋亡蛋白Bax、Smac和细胞色素c的表达增加（P < 0.05），而抗凋亡蛋白Bcl2的表达减少，而与LPS组相比，shERRα+LPS组上诉表达趋势更为明显。本次实验结果表明，抑制ERRα的表达会促进LPS诱导RPMVECs内细胞凋亡的水平。
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| A：四组细胞ERRα、Bax、Bcl2、Cyto-c和Smac代表性的表达情况。B：相关蛋白与GAPDH灰度值相比的定量分析结果。与Ctr和shERRα组比较，aP＜0.01；与LPS组比较，bP＜0.05 图 4 Western Blot检测线粒体凋亡相关蛋白的表达 Fig 4 The expression of mitochondrial apoptosis-related proteins detected by Western blot. |
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ZO-1的细胞免疫荧光的结果显示（如图 5），正常情况下，细胞紧密连接蛋白表达于细胞膜，细胞与细胞之间连接蛋白紧密联系，分布规则，呈网格状。经过LPS处理后，紧密连接蛋白发生降解，连续性中断，分布有所分散。而shERRα+LPS组细胞紧密连接蛋白发生明显的降解，仅有少数分布于细胞膜。
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| 用激光共聚焦显微镜观察四组细胞代表性的免疫荧光图像，红色荧光为ZO-1，DAPI将细胞核染为蓝色荧光（×1000） 图 5 细胞免疫荧光检测ZO-1蛋白的表达情况 Fig 5 The expression of ZO-1 protein detected by cellular immunofluorescence. |
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应用Western Blot检测细胞连接蛋白的表达水平（如图 6），结果显示LPS刺激导致紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、JAM-A和粘附连接蛋白钙黏蛋白E-Ca的表达下降，而ERRα的敲低会加剧这种情况。上述实验证明，抑制ERRα的表达将会加剧LPS诱导的RPMVECs内的连接蛋白的降解，促进细胞通透性的增加。
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| A：四组细胞ZO-1、E-Ca、Occludin和JAM-A代表性的表达情况。B：相关蛋白与β-Actin灰度值相比的定量分析结果。与Ctr和shERRα组比较，aP＜0.01；与LPS组比较，bP＜0.05 图 6 Western Blot检测细胞连接相关蛋白的表达 Fig 6 The expression of junction-related proteins detected by Western blot. |
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本研究通过体外培养RPMVECs显示，ERRα能够负性调节LPS诱导的细胞内ROS的产生、细胞凋亡及连接蛋白的表达情况。通过RNA干扰抑制ERRα能够加剧LPS诱导RPMVECs内ROS的产生、细胞凋亡及连接蛋白的降解。
之前的研究表明，医院内每年因脓毒症和严重脓毒症导致的病死率分别为17%和26%，造成每年约530万人死亡[10]。系统性炎症反应是机体对多种微生物感染的应答，会引起多器官损伤。在脓毒症发生时，肺被认为是最容易受到侵害的器官，会导致急性肺损伤及其严重形式急性呼吸窘迫综合征，这是脓毒症致死的主要原因[11]。生理情况下产生的ROS能维持细胞内稳态，病理情况下氧化与抗氧化失衡时，ROS的过度产生将会引起氧化还原敏感性转录因子（如NF-κB）的激活，将会促进细胞内炎症反应及细胞凋亡[12]。有研究表明，ERRα与PGC-1α相互作用并作为Sirt3的转录因子与其启动子相互结合调控Sirt3的表达，而Sirt3使SOD2在K130位点发生去乙酰化从而减少ROS的聚集[8]。ROS诱导的ROS释放可在生理条件下靶向放大ROS相关信号，但当过量释放时，就会导致内皮细胞发生功能障碍[13]。研究表明，抑制线粒体KATP能够通过调节线粒体ROS的产生而减少高糖诱导的内皮细胞的凋亡[14]。与之前的研究相一致，在本研究当中RPMVECs经LPS刺激后发生了明显的氧化应激，细胞内ROS表达增高，而抑制ERRα的表达却进一步促进ROS的聚集，说明ERRα在急性肺损伤中的保护作用是部分通过调节内皮细胞氧化应激而发挥作用。
由于内皮细胞处于循环血液与周围组织之间的独特位置，即可以受缺氧、脂多糖、吸烟等环境影响，也可以因腺苷、血管紧张素Ⅱ和TNF-α等血管内刺激而发生凋亡。越来越多的证据表明，肺内血管内皮细胞的凋亡在急性肺损伤的发生和发展中起着重要作用[15]。在重度ARDS患者和LPS诱发的ALI小鼠中观察到了大量的肺内皮细胞的凋亡并且使用广谱半胱天冬酶抑制剂抑制细胞凋亡可延长LPS处理后小鼠的存活时间[16]。线粒体诱导的凋亡通道（MAC）是凋亡起始的早期标志，MAC的形成主要受Bcl-2蛋白家族的调节：促凋亡蛋白Bax/Bak促进MAC的形成，而抗凋亡蛋白Bcl-xL抑制MAC的形成[17]。MAC一旦形成就会介导细胞色素c向胞质释放，细胞色素c即会与凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1) 和ATP结合，然后与酶原形式的caspase-9结合形成凋亡小体启动凋亡级联反应。肺内微血管内皮细胞的凋亡将会引起内皮细胞功能障碍，连接蛋白降解，引起肺微血管通透性增高、肺水肿和气血交换功能障碍进而引起肺损伤。本研究中，RPMVECs经LPS刺激后，细胞凋亡比例明显增加，且Western Blot实验结果表明，LPS刺激后促凋亡蛋白Bax、Sma以及细胞色素c有所增加，抗凋亡蛋白Bcl2下降，抑制ERRα表达后加剧了LPS诱导的细胞凋亡程度，进一步促进LPS诱导的连接蛋白的降解。因ZO-1、E-Ca等紧密连接和粘附连接蛋白在维持内皮细胞屏障功能上发挥重要作用，内皮细胞的损伤进一步促进链接蛋白的降解，从而加剧急性肺损伤。结果表明，ERRα能够通过调节内皮细胞凋亡而缓解内皮细胞的高渗透性，从而在急性肺损伤中发挥保护作用。
本研究通过抑制ERRα的表达探索脂多糖诱导的内皮细胞凋亡及连接蛋白的影响。结果表明，LPS诱导内皮细胞ROS的产生及Bcl2/Bax介导的凋亡，并能加剧连接蛋白ZO-1，Occludin、JAM-A和E-Ca的降解；而抑制ERRα的表达能明显加剧LPS诱导的内皮细胞损伤的情况。综上所述，ERRα能够部分通过负性调节肺微血管内皮细胞内的氧化应激及凋亡，影响肺微血管内皮的屏障功能，从而调控脓毒症诱导的急性肺损伤。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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