2021, Vol. 30
2. 山东第一医科大学第一附属医院（山东省千佛山医院）神经内科 山东省神经免疫研究所，济南 250014;
3. 山东省风湿免疫病转化医学重点实验室，济南 250014
2. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, Jinan 250014, China; Shandong Institute of Neuroimmunology, Jinan 250014, China;
3. Shandong Provincial Key Laboratory for Rheumatic Disease and Translational medicine, Jinan 250014, China
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是血管壁脂质沉积、粥样斑块形成的慢性炎症过程，可导致心肌梗死、脑梗死等致命性疾病[1]。氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox LDL）等抗原在动脉内膜下触发了固有免疫（非特异性免疫）和适应性免疫（特异性免疫）反应[2]。在斑块的免疫炎症反应中，以T细胞为特征的细胞免疫起着重要作用。因此，AS的本质是免疫反应发生的炎症过程[2]。DCs是免疫系统中最强的一种专职抗原递呈细胞（antigen presenting cells, APCs），呈递各种抗原给T细胞，通过其产生的细胞因子对免疫炎症反应产生重要影响[3]。DCs是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，其最经典的功能是活化T细胞，所以DCs在AS发生发展过程中起着至关重要的作用。
高血压是一种低度炎症性疾病，是AS最重要的危险因素之一[4]。在高血压中，固有免疫直接或通过适应性免疫激活炎症反应和氧化应激。研究表明，免疫细胞浸润、肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system，RAS）、氧化应激和交感神经张力在高血压的发生发展中起重要作用。免疫细胞减少可改善内皮功能，减少氧化应激，降低血管张力[5]。血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blockers, ARBs)与肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的主要生物活性肽-血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的I型受体(angiotensin Ⅱ receptor type 1, AT1)结合[6]，可以有效降血压和治疗心脏病。DCs和T淋巴细胞等免疫细胞也表达AT1受体[7]。通过与AT1受体结合，ARBs阻断AngII生物效应，发挥降压、抗炎及抗AS作用。奥美沙坦是ARBs类药物中的一种，少有文献研究ARBs与免疫炎症作用，因此，本研究拟探讨ARBs类药物是否可以通过调控DCs来发挥对AS的保护作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物雌性Lewis大鼠，6~9周龄，体质量150~185 g，购自北京维通利华有限公司。SPF级动物房，室温25℃，提供合适的水和食物，从7:00至19:00给予灯光照射。
1.2 实验试剂奥美沙坦（第一三共投资有限公司提供）、卵白蛋白（ovalbumin, OVA）、不完全弗氏佐剂、二甲亚砜（dimethylsulfoxide, DMSO）、牛血清蛋白（bovine serum albumi, BSA）、1640培养基(含2.05 mmol/L谷氨酰胺、胎牛血清)、胎牛血清（fetal calf serum, FCS）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）（购自西格玛公司）、MHC Ⅱ抗体（购自eBioscience公司）、抗大鼠MHC Ⅱ抗体、抗大鼠CD80抗体、抗大鼠CD86抗体、抗大鼠IL-10抗体（购自BioLegend公司）、CFSE试剂盒（购自Dojindo公司）、IFN-γ ELISA试剂盒、IFN-γ抗体（购自深圳市达科为生物技术有限公司）。
1.3 试验方法 1.3.1 免疫大鼠模型的建立把OVA溶于生理盐水、不完全弗氏佐剂和H37Ra株热灭活结核杆菌中。每只大鼠用200 μL溶液，在大鼠的双后足垫皮下注射。注射当天为0 d，在第8天用等剂量于大鼠背部再次注射1次，进行2次免疫。对照组给予相同体积不含OVA的溶液200 μL。
1.3.2 DCs的提取培养及奥美沙坦的修饰于第2次免疫后第5天，无菌取大鼠的股骨和胫骨，无菌PBS冲洗骨髓腔，研磨，破膜后继续培养，3 d后去掉悬浮细胞[8]。培养8 d时加入奥美沙坦（终浓度10 μmol/L）或等体积DMSO，继续培养。孵育至第10天，收集悬浮细胞。
1.3.3 流式检测不同处理组DCs表面CD80、CD86、MHC Ⅱ的表达每管取1×106个细胞，加入BSA洗涤，各管中分别加入抗大鼠MHC Ⅱ、抗大鼠CD80、抗大鼠CD86抗体，4℃孵育30 min，加入BSA洗涤，加PBS重悬，上流式细胞仪检测。
1.3.4 流式检测不同处理组DCs胞内IL-10、TGF-β的表达每样本取1×106个细胞，加PBS洗涤，加入2%多聚甲醛，4℃孵育20 min，加0.5%皂甙破膜，室温放置20 min。加入抗大鼠IL-10抗体（对照管除外）、抗大鼠TGF-β抗体（对照管除外），避光孵育30 min。加入PBS重悬细胞后上机检测。
1.3.5 制备淋巴结单个核细胞悬液无菌条件下取OVA免疫大鼠的双侧腹股沟淋巴结，置入无菌滤网内，无菌研磨，直至组织变白，完全吸取研磨液，制备淋巴结单个核细胞悬液。调整细胞浓度为2×107个细胞/mL，备用。
1.3.6 CD4+ T细胞的尼龙面柱分选T细胞尼龙棉柱滤过法[9]：取150 mg尼龙棉，填入无菌注射器内，高压锅灭菌，烤箱烤干，备用。将尼龙棉柱定6 cm高，此高度可有效地过滤2×107个细胞。用浓度为200 mL/L FCS和1640培养基洗涤尼龙棉柱各2次，37℃放置1 h。上柱前，先将尼龙棉柱内的平衡液放出，加入细胞数为2×107个/mL的淋巴细胞混悬液3 mL，平放尼龙棉柱，以毛细滴管伸入柱内的界面加入0.5 mL预温至37℃的含10% FCS的1640培养基封口，于37℃，孵育1 h。把含10% FCS的1640培养基37℃预温，取20 mL洗涤尼龙棉柱3次，流速20滴/min，收集最初的15 mL流出液，计数细胞并调整细胞浓度至1×107个/mL浓度，此即为分离的纯化CD4+ T淋巴细胞。
1.3.7 CFSE细胞增殖实验取10×106个CD4+ T淋巴细胞，加入CFSE 0.5 μL /管；37℃孵育15 min；冰上放置5 min；加入10 mL完全培养基重悬细胞；种于24孔板，1 mL/孔；加入100 μL DCs；加入OVA 20 μL/孔；培养72 h，分别收集细胞和上清液，流式细胞仪检测。
1.3.8 细胞培养上清液中IL-10和IFN-γ检测经OVA刺激的大鼠淋巴结CD4+ T细胞与DCs联合培养72 h后留取上清液。使用ELISA方法检测细胞因子IFN-γ的表达水平，操作完全依照试剂盒说明书进行。
1.4 统计学方法计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，用SPSS 17.0软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 奥美沙坦诱导耐受性DCs的产生及其对DCs胞内细胞因子IL-10和TGF-β的影响采用流式细胞仪检测发现，OLM-DCs较Con-DCs明显低表达MHC Ⅱ（P < 0.05），CD86表达有降低趋势，但差异无统计学意义（图 1A）。通过ELISA测定，OLM-DCs组较Con-DCs组高表达细胞因子IL-10（P = 0.07），两组间TGF-β的表达差异无统计学意义（图 1B）。
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| 图 1 DCs表面CD80、CD86、MHC Ⅱ分子及其胞内IL-10、TGF-β的表达 Fig 1 Expressions of CD80, CD86, MHC Ⅱ on the surface of DCs and their intracellular IL-10 and TGF-β expression |
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采用CFSE检测T淋巴细胞增殖，实验结果显示，OLM-DCs组T淋巴细胞增殖反应明显低于Con-DCs组，两组之间差异有统计学意义(P < 0.01)（图 2A）。通过ELISA测定OVA免疫大鼠淋巴结T淋巴细胞培养上清液中IFN-γ水平，结果表明OLM-DCs组比Con-DCs组IFN-γ分泌水平下降，但差异无统计学意义（图 2B）。
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| a与未经奥美沙坦修饰的DCs组比较，P < 0.01 图 2 细胞共培养后T细胞增殖情况和上清液中IFN-γ水平 Fig 2 T cell proliferation and IFN-γ level in supernatant after cell co-culture |
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为了验证奥美沙坦对DCs是否具有免疫调控作用，在临床降压的同时是否对AS免疫反应起作用，我们在体外培养DCs，分别经奥美沙坦及其溶剂进行干预。结果发现，在体外奥美沙坦修饰的DCs表面明显低表达MHC Ⅱ、胞内高表达IL-10。这说明奥美沙坦能够诱导耐受性DCs的产生，而耐受性DCs在体外进一步抑制T淋巴细胞增殖和Th1细胞因子的分泌。因此，奥美沙坦作为一种ARBs类降压药物，在降压的同时还具有抗炎作用，为抗AS的预防提供了多靶点保护。
未成熟的DCs具有捕获抗原的能力，低表达共刺激分子MHC Ⅱ、CD80、CD86和CD40[10]，分泌抗炎性细胞因子(IL-10、TGF-β)。成熟的DCs抗原捕获能力下调，抗原提呈能力增强，高表达MHC II、CD80、CD86，可以促使T细胞活化、增殖，促进炎性反应。研究发现，正常动脉壁内膜下存有DCs，与内皮细胞和平滑肌细胞（VSMCs）直接接触。AS斑块中存有免疫炎性细胞包括巨噬细胞、CD4+和CD8+ T细胞、DCs等。AS中DCs的聚集加剧了斑块的不稳定和内皮损伤程度[11]。因此，免疫炎症反应在AS的发生和进展中起着重要作用，且全程参与了AS的发病机制[12]，以T细胞为特征的细胞免疫起着关键作用。Ox LDL等抗原在动脉内膜下触发了固有免疫和适应性免疫反应[2]。在功能紊乱的动脉内皮细胞内膜下，Ox LDL等通过模式受体与DCs、巨噬细胞受体结合，有效地激活固有免疫，分泌大量的炎性因子, 从而启动了AS的炎症反应。在AS中，DCs能够吞噬ox LDL，在共刺激分子CD80、CD86、MHC II帮助下，递呈给CD4+ T细胞，促使CD4+ T细胞向Th1细胞分化，分泌IFN-γ、IL-12、TNF-α等促炎细胞因子，进一步加重AS中的炎症反应。通过对VSMCs的作用，抑制胶原合成，破坏斑块厚纤维帽的稳定性，最终使纤维帽变薄和斑块破裂，激活的DCs继续维持致病性Th1反应，促进AS[10]。
在斑块形成的早期，DCs摄取脂质，促进泡沫细胞的形成[13]。在AS脂肪条纹到粥样斑块成熟的过程中，不成熟的DCs发育成熟，数量急剧增加[14]。DCs在形成泡沫细胞后仍维持其抗原呈递功能并激活T细胞。人类AS斑块T细胞中70%为CD4+ T细胞，其中最多的是Th1细胞[1]。动物实验证实，在IFN-γ缺陷小鼠[15]、T-bet缺陷小鼠[16]中AS发展延缓。T细胞亚群是适应性免疫的关键组分，通过其产生的细胞因子对AS免疫炎症反应产生重要影响[3]。
高血压是AS的重要原因之一，RAS在高血压发病机制中起重要作用。RAS活化使血管损伤恶化[7]。Ang Ⅱ是RAS下游主要活性肽，Ang Ⅱ的中枢和升压作用对T细胞活化和血管炎症的发生至关重要。Ang Ⅱ与AT1作用，激活磷脂酶，影响NF-κB途径，降低NO水平，加重血管功能障碍[17]。长期高血压血流动力学改变，可以损伤血管内皮细胞，产生与病原体感染相似的炎症反应，使免疫系统对内部损伤反应过度，促进NF-κB途径[17]。DCs捕获“损伤相关分子模式”，递呈抗原的同时，生成过氧化物和活性氧增多，活化T细胞，分泌炎症因子，促进炎症反应。血管炎症可以进一步导致内皮功能障碍，血管阻力增加，动脉重塑和硬化[18]。ARBs类药物可以抑制AT1/NF-κB途径介导的免疫炎症反应[19-20]。研究发现奥美沙坦可抑制VSMCs氧化应激和AS[21]。本实验研究发现奥美沙坦具有抑制DCs成熟，诱导耐受性DCs产生，抑制致敏T淋巴细胞增殖。这些研究结果提示奥美沙坦不仅具有降压作用，还能够抑制特异性免疫反应，进而在预防AS特异性免疫反应中起到重要作用，推测其可能机制是通过NF-κB途径。
本研究为体外细胞实验研究，奥美沙坦在动脉粥样硬化的特异性免疫反应中的免疫抑制作用，需要在体内研究中进一步证实。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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