2022, Vol. 31
2. 中国人民解放军联勤保障部队 第九四二医院检验科 银川 750004;
3. 宁夏宁东能源化工基地公共卫生中心 银川 750004
2. Clinical Laboratory Department, the 942th Hospital of the Joint Service of Chinese People′s Liberation Army, Yinchuan 750004, China;
3. Public Health Center of Ningdong Energy and Chemical Industry Base, Yinchuan 750004, China
一氧化碳中毒迟发性脑病（Delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning, DEACMP）为一氧化碳中毒后最为常见的并发症之一，发病率[1]高达10%~30%，国外报道高达13%~50%，其具有发病率、致残率及致死率高等特点[2]。DEACMP的发病机制目前尚不明确，相关研究显示可能与NO介导的损伤、缺血缺氧、细胞凋亡、免疫及炎症介导损伤等相关[3]。其中NO介导的神经系统损伤为DEACMP发病的重要机制之一，在一氧化碳中毒时，NO会出现不同程度的增高，而一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）则是NO催化诱导的关键酶[4]。NOS主要有三个亚型：神经元型NOS（nNOS）、诱导型NOS（iNOS）、内皮型NOS（eNOS）。当大脑处于缺血缺氧状态时，NOS的表达增加，诱导生成过量的NO进而造成脑损害[5]。在缺血缺氧早期以nNOS和eNOS增高为主，晚期则以iNOS增高为主。有研究[6]显示，活化小胶质细胞产生的iNOS诱导NO生成可能为延迟性神经损伤的发病机制之一。相关研究结果表明[7]，NO-NOS系统参与了DEACMP的发病，本课题组前期动物实验也发现[8]，iNOS在DEACMP后期大鼠海马区表达明显增高，由此也提示iNOS可能与DEACMP的发病具有一定相关性。基于以上原因，本研究通过对比DEACMP患者与非DEACMP患者不同时期血清NO、nNOS、iNOS及eNOS的变化，探讨NOS，尤其是iNOS与DEACMP的相关性，为探索DEACMP的发病机制提供理论依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象通过前瞻性研究方法，收集2019年6月至2021年6月宁夏医科大学总医院急诊ICU收治的急性一氧化氮中毒患者相关信息及临床资料，包括患者的性别、年龄、一氧化碳接触时长、入院时格拉斯哥评分（GCS）、昏迷时长、入院时中毒严重程度、是否发生DEACMP、DEACMP发生时间以及是否存活等相关资料。所有患者分别在入院时，入院后第7天、第14天留取静脉血4 mL，离心（3 000 r/min）15 min，分离上清液后于-80℃冰箱冻存待测。一氧化碳中毒及DEACMP的诊断采用《急诊内科学》[9]中关于一氧化碳中毒及DEACMP的诊断标准。
纳入标准：①明确诊断为急性一氧化碳中毒的患者。②一氧化碳中毒至住院时间在48 h以内。③患者或患者家属知情同意。
排除标准：①合并其他有毒气体或毒物中毒的患者。②入院前或入院后出现心搏停止，行心肺复苏的患者。③合并脑出血或脑梗塞的患者。④既往存在精神、神经系统疾病的患者。⑤合并感染而导致NO及NOS异常的疾病。⑥存在其他非感染因素导致NO或NOS异常的患者。
剔除标准：①入选病例在研究期间出现心脏停搏，行心肺复苏的患者。②要求退出本研究的患者。③未能按本实验设计完成治疗及检查的患者。④出现其他可能影响本试验结果的情况。
本研究通过宁夏医科大学总医院伦理委员会审查（伦理编号：2019–481），所有患者在纳入前均已签署知情同意书。
1.2 治疗方法所有患者治疗方案均参照《急诊内科学》[9]中关于一氧化碳中毒的治疗方法，包括：高压氧治疗、生命支持（包括呼吸功能支持、循环功能支持等）等。
1.3 标本检测方法通过双抗体夹心法（ELISA）分别检测患者入院时、入院后第7天及第14天NO、nNOS、iNOS及eNOS水平。NO检测试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司，生产批号：2021-03；nNOS、iNOS及eNOS检测试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司，生产批号分别为：L210309534、L210131637、L210309526。检测方法及过程严格按照说明书进行。
1.4 统计学方法采用R语言（Ver 4.1.0）进行统计分析。正态分布的计数资料采用均数±标准差（
研究期间共有95例患者符合纳入标准进入本研究，其中有17例患者未能按照实验方案完成检查予以剔除，最终纳入患者78例，其中男性49（62.82%）例，女性29（37.18%）例。年龄（53.96±14.95）岁，DEACMP患者20例（25.64%），死亡1例（1.28%）。一氧化碳中毒患者的一般资料见表 1。
| 指标 | 值（n=78） |
| 年龄[M(IQR), 岁] | 55.5(21.5) |
| 一氧化碳暴露时间[M(IQR), h] | 9(3.75) |
| 性别（n，%） | |
| 男 | 49(62.82) |
| 女 | 29(37.18) |
| GCS评分[M(IQR)] | 11.50(8.00) |
| 中毒至DEACMP发生时长[M(IQR), d] | 16.00(10.75) |
| NO水平[M(IQR), μmol/L] | |
| 入院时 | 325.35(76.8) |
| 第7天 | 332.77(49.57) |
| 第14天 | 351.47(109.86) |
| nNOS水平[M(IQR), ng/mL] | |
| 入院时 | 0.97(0.37) |
| 第7天 | 0.80(0.46) |
| 第14天 | 0.92(0.38) |
| iNOS水平[M(IQR), ng/mL] | |
| 入院时 | 0.34(0.15) |
| 第7天 | 0.44(0.86) |
| 第14天 | 0.25(0.53) |
| eNOS水平[M(IQR), ng/mL] | |
| 入院时 | 0.26(0.01) |
| 第7天 | 0.26(0.01) |
| 第14天 | 0.26(0.11) |
| 中毒严重程度（n，%） | |
| 轻度 | 28(35.9) |
| 中度 | 13(16.67) |
| 重度 | 37(47.44) |
| DEACMP例数（n，%） | 20(25.64) |
| 死亡（n，%） | 8(5.03) |
单因素分析结果显示，相较于非DEACMP患者，DEACMP患者一氧化碳暴露时间增加3 h（95%CI: 1.00, 5.00），GCS评分低5分（95%CI: 1.00, 6.00）；在一氧化碳中毒严重程度上，DEACMP患者明显高于非DEACMP的患者（90.00% vs. 32.76%）；DEACMP患者iNOS在入院后第7天和第14天高于入院时，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），NO、nNOS、eNOS水平在各个时间点差异均无统计学意义；非DEACMP患者NO、nNOS、iNOS、eNOS水平在各个时间点的差异均无统计学意义（P > 0.05）。在入院后第7天及第14天，DEACMP患者的iNOS水平高于非DEACMP患者（P < 0.01）；在入院后第14天，DEACMP患者的nNOS低于非DEACMP患者，差异具有统计学意义（P < 0.05）。两组患者在年龄、性别及不同时间点的NO、nNOS、iNOS、eNOS水平上的差异均无统计学意义（P > 0.05），见表 2。不同时间点NO、nNOS、iNOS及eNOS的变化折线图显示（见图 1），DEACMP及非DEACMP患者血清iNOS在入院时相接近，在入院后第7天及第14天DEACMP患者明显高于非DEACMP患者。
| 指标 | 一氧化碳中毒 | 估计差值(95%CI) | t/U值 | P值 | |
| DEACMP组（n=20） | 非DEACMP组(n=58) | ||||
| 年龄（，岁） |
57.6±12.26 | 52.71±15.67 | 4.89(-2.80, 12.58) | 1.27 | 0.21 |
| 一氧化碳暴露时间[M(IQR), h] | 10.00(2.12) | 8.00(5.75) | 3.00(1.00, 5.00) | 897.50 | < 0.01 |
| GCS评分[M(IQR)] | 8.00(2.25) | 13.00(7.00) | -5.00(-6.00, -1.00) | 323.00 | < 0.01 |
| NO水平[M(IQR), μmol/L] | |||||
| 入院时 | 329.72(68.81) | 325.35(79.95) | 12.77(-35.03, 61.17) | 370.50 | 0.58 |
| 第7天 | 335.79(134.05) | 320.62(39.11) | -1.34(-40.47, 92.37) | 84.00 | 0.98 |
| 第14天 | 290.67(59.84) | 367.46(100.31) | -76.79(-175.10, 42.01) | 11.00 | 0.34 |
| nNOS水平[M(IQR), ng/mL] | |||||
| 入院时 | 0.85(0.45) | 1.02(0.40) | -0.12(-0.31, 0.07) | 264.00 | 0.25 |
| 第7天 | 0.77(0.30) | 0.81(0.57) | -0.03(-0.33, 0.22) | 79.00 | 0.79 |
| 第14天 | 0.73(0.19) | 1.10(0.48) | -0.42(-1.02, -0.07) | 4.00 | 0.03 |
| iNOS水平[M(IQR), ng/mL] | |||||
| 入院时 | 0.39(0.27) | 0.34(0.14) | 0.03(-0.03, 0.13) | 390.00 | 0.39 |
| 第7天 | 1.56(0.70)a | 0.26(0.21) | 1.16(0.61, 1.40) | 164.00 | < 0.01 |
| 第14天 | 1.32(0.81)b | 0.24(0.01) | 1.08(0.21, 1.53) | 35.00 | < 0.01 |
| eNOS水平[M(IQR), ng/mL] | |||||
| 入院时 | 0.27(0.09) | 0.26(0.01) | 0.00(-0.00, 0.06) | 402.00 | 0.29 |
| 第7天 | 0.26(0.01) | 0.26(0.01) | 0.00(-0.01, 0.01) | 70.00 | 0.75 |
| 第14天 | 0.37(0.11) | 0.26(0.01) | 0.10(0.00, 0.16) | 28.50 | 0.09 |
| 性别（n，%） | > 0.99 | ||||
| 男 | 13(65.00) | 36(62.07) | |||
| 女 | 7(35.00) | 22(37.93) | |||
| 中毒严重程度（n，%） | < 0.01 | ||||
| 轻度 | 1(5.00) | 27(46.55) | |||
| 中度 | 1(5.00) | 12(20.69) | |||
| 重度 | 18(90.00) | 19(32.76) | |||
| 注：与入院时相比较，aP < 0.05；bP < 0.01 | |||||
|
| 图 1 不同时间点DEACMP患者与非DEACMP患者NO(A)、nNOS(B)、iNOS(C)及eNOS(D)的变化 Fig 1 Differences of NO (A), nNOS(B), iNOS (C) and eNOS (D) in patients with and without DEACMP at different time points |
|
|
通过将上述单因素有意义的变量分别建立GEE后的结果显示，与非DEACMP的患者相比，无论是否调整一氧化碳暴露时间、GCS评分、昏迷时间及一氧化碳中毒严重程度，DEACMP患者iNOS水平均高于非DEACMP的患者，差异具有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。nNOS水平除在调整一氧化碳暴露时间的GEE模型中DEACMP患者高于未发生DEACMP患者外，NO、nNOS及eNOS水平均无明显差异（P > 0.05），见表 3。
| 模型a | 评估值(95%CI) | P值 |
| 未调整 | ||
| NO(μmol/L) | 52.09(-91.91, 196.08) | 0.48 |
| nNOS(ng/mL) | -0.14(-0.28, 0.01) | 0.07 |
| iNOS(ng/mL) | 0.43(0.23, 0.64) | < 0.01 |
| eNOS(ng/mL) | 0.02(0.00, 0.05) | 0.08 |
| 调整一氧化碳暴露时间 | ||
| NO(μmol/L) | 30.89(-57.06, 118.84) | 0.49 |
| nNOS(ng/mL) | -0.15(-0.30, 0.00) | < 0.05 |
| iNOS(ng/mL) | 0.42(0.17, 0.66) | < 0.01 |
| eNOS(ng/mL) | 0.02(-0.01, 0.05) | 0.17 |
| 调整一氧化碳暴露时间、GCS评分 | ||
| NO(μmol/L) | 31.81(-41.98, 105.59) | 0.40 |
| nNOS(ng/mL) | -0.14(-0.31, 0.04) | 0.12 |
| iNOS(ng/mL) | 0.40(0.11, 0.70) | < 0.01 |
| eNOS(ng/mL) | 0.02(-0.01, 0.05) | 0.28 |
| 调整一氧化碳暴露时间、GCS评分、昏迷时间 | ||
| NO(μmol/L) | 30.8(-41.25, 102.84) | 0.40 |
| nNOS(ng/mL) | -0.14(-0.30, 0.02) | 0.08 |
| iNOS(ng/mL) | 0.40(0.09, 0.70) | 0.01 |
| eNOS(ng/mL) | 0.02(-0.01, 0.04) | 0.22 |
| 调整一氧化碳暴露时间、GCS评分、昏迷时间、一氧化碳中毒严重程度 | ||
| NO(μmol/L) | 49.5(-33.91, 132.91) | 0.24 |
| nNOS(ng/mL) | -0.14(-0.29, 0.01) | 0.07 |
| iNOS(ng/mL) | 0.37(0.01, 0.72) | 0.04 |
| eNOS(ng/mL) | 0.02(-0.01, 0.05) | 0.18 |
| 注：a与非DEACMP患者相比不同模型下NO、nNOS、iNOS及eNOS水平的差异。 | ||
本研究结果发现，在不考虑一氧化碳中毒患者中毒时一氧化碳接触时间、昏迷程度（GCS评分）、中毒严重程度等因素时，DEACMP患者在入院后第7天及第14天iNOS水平高于非DEACMP的患者。然而考虑到一氧化碳接触时间、昏迷程度及患者病情严重程度等也可能会导致NOS及iNOS上的差异，且本组病例中DEACMP患者的一氧化碳暴露时间、昏迷程度及一氧化碳中毒严重程度均高于非DEACMP的患者，故而通过分别调整一氧化碳暴露时间、昏迷程度及一氧化碳中毒严重程度后的GEE模型发现，无论是否调整，DEACMP患者iNOS在入院后第7天及第14天均高于非DEACMP的患者，提示DEACMP患者iNOS的持续表达可能是导致DEACMP发病的原因之一。而无论是NO、nNOS还是eNOS，两组间差异无统计学意义，提示nNOS及eNOS可能并不是导致DEACMP发生的关键NOS。由于NOS的作用主要为诱导NO的产生进而损伤中枢神经系统，因而理论上DEACMP患者神经系统及血清的NO水平应高于非DEACMP患者。本研究结果发现DEACMP患者血清NO水平呈持续上升趋势，而非DEACMP患者的NO水平呈持续下降趋势，虽然二者经统计学分析差异并无统计学意义，但这种趋势也符合NO诱导DEACMP发生的机制。造成NO增高的原因较多[10]，但并非所有NO增高的患者都会出现神经系统损伤，说明NO血清水平的增高和中枢神经系统NO的增高可能并不一致。iNOS主要存在于神经胶质细胞和巨噬细胞，其次是神经元，在多数情况下只在免疫应答和神经损伤后才表达，在非神经系统损伤时并不会表达。
DEACMP发病机制复杂，至今尚不明确[11]，NO介导的神经系统损伤为DEACMP的发病机制之一[12-15]，高浓度的NO可诱导神经细胞变性、坏死、凋亡[15-16]。NO主要由NOS催化产生，在NOS的三个亚型中，iNOS是诱导产生NO的主要酶之一，激活后作用强、作用时间长[18]，会促使生成大量NO诱导神经细胞损伤[19, 20]。相关研究显示[21]，NOS和NO在血管性痴呆的发病机制中起到了重要的作用，与阿尔茨海默病及痴呆等关系密切[22]。Wang等[23]则发现血清高iNOS水平与卒中后抑郁相关，提示iNOS表达的增加参与、诱导神经系统损伤。而抑制一氧化氮合酶后则可减轻神经毒性[24]、减少神经元的凋亡等[21]。本研究组前期的动物研究也发现[8]，在大鼠的DEACMP模型中，DEACMP大鼠海马CA3区iNOS的AOD值以及蛋白表达在造模后第7、14、21、28天持续呈高表达，提示iNOS可能参与了DEACMP的发病过程。iNOS在中枢神经系统持续的高表达机制并不明确，可能与一氧化碳中毒后持续脑缺血缺氧时间、脑损害的严重程度等相关。目前已经有众多研究结果显示[2, 11]，一氧化碳暴露时间、中毒后患者昏迷时间的长短等均与DEACMP的发生关系密切。本研究单因素分析结果也同样显示，DEACMP患者一氧化碳暴露中位时间较非DEACMP组患者高出3 h，入院时GCS评分较非DEACMP患者低5分，在病情严重程度上，重度中毒的患者DEACMP组比例更高，两组间的差异均具有统计学意义。以上结果也提示DEACMP组患者的中枢神经系统损伤更重，因而可能为iNOS后续持续高表达的原因之一。
本研究虽提示iNOS水平的增加与DEACMP的发生密切相关，但由于一氧化碳中毒后机体会出现广泛的缺血缺氧性损伤，可能会通过多种途径影响NO及NOS的释放，故而iNOS与DEACMP的相关性需更进一步的探讨及研究。同时，由于本研究样本量的限制，可能存在尚未控制的混杂因素，尚需大样本、多中心的前瞻性研究来进一步探讨NOS在DEACMP中的作用。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明：吴嘉荔、杨立山：研究设计、实施研究；杨梦丽、冀晓静：试验标本检验、分析；李强、杨婉珍、刘聪、王高飞、马斌、胡小东：实施研究、数据收集；杨立山：对文章的知识内容做批评性审阅；吴嘉荔：统计分析、文章撰写
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