2022, Vol. 31
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是世界范围内心血管原因死亡的主要病因，通过早期血运重建及时地恢复缺血心肌的血流灌注，可显著改善心肌血供并减少心肌坏死[1]。然而闭塞冠脉的血流恢复会导致心肌缺血-再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI），引起心肌组织进行性损伤甚至坏死，严重制约了再灌注治疗的临床净获益，但目前临床上仍缺乏有效的防治措施[2]。因此深入探索MI/RI的发病机制及有效干预靶点，在早期血运重建获益的基础上最大程度减轻MI/RI，具有重要的理论价值和临床意义。
程序性坏死目前已被证明是MI/RI中心肌细胞主要死亡方式[3]。在MI/RI过程中，RIPK1被磷酸化激活后可进一步活化受体交联蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3）以形成坏死小体，进而活化混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL）导致坏死性膜破裂[4]。程序性坏死的主要表现为细胞水肿、细胞膜破裂以及细胞内免疫复合物释放到细胞外引起无菌性炎症反应。研究发现，抑制程序性坏死发生可减少约50%的心肌细胞死亡，而通过Caspase抑制剂减少凋亡发生仅能减少30%的心肌细胞死亡，提示程序性坏死可能是MI/RI中细胞的主要死亡方式[5]。因此，抑制MI/RI中程序性坏死的发生是减轻MI/RI的有效策略。
细胞FLICE样抑制蛋白（cellular FLICE-like inhibitory protein, cFLIP）是Caspase-8的天然抑制蛋白，因此既往研究多探讨cFLIP对凋亡的抑制作用[6]。cFLIP在哺乳动物中主要表达为两种同源蛋白：分子量为55 kDa的长型cFLIPL和26 kDa的短型cFLIPS。Tsuchiya等[7]报道，cFLIP还可通过其氨基端的死亡作用域（death effect domain, DED）结合RIPK1，并促进其裂解从而抑制程序性坏死的发生。然而，cFLIP是否对MI/RI中程序性坏死具有调控作用仍未被研究。本研究拟构建重组腺病毒上调心肌细胞cFLIP表达，分别研究cFLIP对心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）损伤以及大鼠心肌缺血-再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤中的作用，并进一步探讨cFLIP对MI/RI诱导的程序性坏死的调节机制，为防治MI/RI提供新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 构建cFLIP重组腺病毒本研究前期已成功构建Ad-cFLIPL和Ad-cFLIPS重组腺病毒，并成功转染至原代心肌细胞[8]。由于cFLIPL和cFLIPS的3' 端和5' 端的基因序列非常相似，仅编码序列（coding sequence, CDS）区相差789 bp，因此直接采用基因编辑技术获得携带cFLIPL、cFLIPS基因序列，以细胞内同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒，经HEK293细胞包装后，扩增、浓缩，最终获得高效、稳定表达cFLIPL、cFLIPS基因的重组腺病毒Ad-cFLIPL、Ad-cFLIPS，应用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。
1.2 原代心肌细胞分离培养原代心肌细胞提取自乳鼠心尖组织，1~3 d鼠龄的乳鼠均购自三峡大学实验动物中心。乳鼠经深度麻醉后处死，使用75%的酒精充分消毒后取心尖组织，将心尖组织剪至约1 mm3的小块后，使用经预冷过的含1%抗青霉素-链霉素溶液的磷酸缓冲盐溶液反复冲洗以去除残留血液。使用胰酶联合I型胶原酶分离、消化乳鼠心肌组织，采用差速贴壁分离法联合溴脱氧尿苷纯化原代心肌细胞，然而使用α-actin染色鉴定。原代心肌细胞培养于含10%胎牛血清（美国GIBCO公司）的DMEM培养基（Hyclone公司）和37℃、5%CO2的培养箱（金西盟公司）中，隔天进行换液。
1.3 细胞分组及H/R模型构建将重组腺病毒转染至原代心肌细胞，于37℃、5%CO2的培养箱中培养4 h后更换完全培养基继续培养48 h，前期研究已证明，当感染复数为100时转染效率达（90.30±3.62）%[8]。根据既往研究方法[9]，采用安宁包缺氧体系（日本三菱MGC）对原代心肌细胞进行缺氧处理，安宁包可迅速吸收氧气，1 h内可将密闭培养罐中的O2含量降低至0.1%，并维持5% CO2。将细胞培养基换成无血清低糖培养基后，将细胞置于密封培养盒中进行缺氧处理，并将密封培养盒置入37℃培养箱中。缺氧4 h后，将培养基换成完全培养基后，将细胞置于5%CO2 37℃培养箱中进行复氧12 h，对照组在正常条件下培养相同时间。细胞分组及处理如表 1。
| 组别 | 处理 |
| Control组 | 正常培养基孵育16 h |
| H/R组 | 缺氧4 h，复氧12 h |
| Ad-NC组 | 转染Ad-NC后缺氧4 h，复氧12 h |
| Ad-cFLIPL组 | 转染Ad-cFLIPL后缺氧4 h，复氧12 h |
| Ad-cFLIPS组 | 转染Ad-cFLIPS后缺氧4 h，复氧12 h |
| Ad-cFLIPL+cFLIPS组 | 转染Ad-cFLIPL+cFLIPS后缺氧4 h，复氧12 h |
将细胞以5×103/孔的密度种于96孔板中，每组做5个复孔，按上述方法进行病毒转染和H/R模型建立。复氧结束后，向每孔缓慢加入10 μL CCK-8试剂（日本同仁），避免气泡产生，置于培养箱中孵育2~4 h后，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度。每组细胞活性（%）=（OD处理－OD对照）/OD对照×100%。
1.5 免疫荧光检测细胞模型构建完成后收集心肌细胞样本置于1.5 mL离心管中，经1 500 r/min离心5 min后弃上清液，使用1 mL细胞染色缓冲液重悬细胞后使用4' , 6-二脒基-2-苯基吲哚（4' , 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）、碘化丙啶（propidiumlodide, PI）染色液（中国碧云天）各5μL于4℃避光孵育细胞30 min后，使用荧光显微镜（德国Leica公司）观察蓝色和红色荧光表达。
1.6 动物模型构建30只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（220~250 g，SPF级）购自三峡大学实验动物中心，按随机数字表法将大鼠分为5组（见表 2）。参照参考文献[9]，进行重组腺病毒的转染及I/R模型构建。腹腔注射3%苯巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，固定、剃毛及消毒后，行气管插管。逐层分离左胸并于胸骨左缘4~5肋间打开胸腔，在心尖部和心前区多点注射重组腺病毒后逐层缝合胸部伤口和颈部伤口。病毒转染3 d后行I/R模型构建，如上所述麻醉、固定以及呼吸支持后，逐层打开左侧胸腔，在左心耳下缘2~3 mm处使用6-0丝线将左前降支和凹槽乳胶管一起结扎30 min后剪开缝线并取出胶条进行再灌注3 h。动物模型构建过程中记录心电图，以抬高的ST段下降、T波逐渐恢复以确定再灌注成功。收集大鼠血液标本3 mL置于4℃离心机（香港Heal Force公司）中3 000 r/min，离心10 min，留取血清于-80℃冰箱（中国海尔公司）保存。收集大鼠左心室组织标本，放入用无尘纸快速吸取血液，使用锡箔纸包裹后置于-80℃冰箱保存。
| 组别 | 处理 |
| Sham+Ad-NC组 | 心尖注射Ad-NC，只穿刺不结扎 |
| I/R+Ad-NC组 | 心尖注射Ad-NC，缺血30 min再灌注3 h |
| I/R+Ad-cFLIPL组 | 心尖注射Ad-cFLIPL，缺血30 min再灌注3 h |
| I/R+Ad-cFLIPS组 | 心尖注射Ad-cFLIPS，缺血30 min再灌注3 h |
| I/R+Ad-cFLIPL+cFLIPS组 | 心尖注射Ad-cFLIPL+cFLIPS，缺血30 min再灌注3 h |
将大鼠血液标本于2 000 r/min离心15 min后抽取上层血清，于全自动生化分析仪（德国西门子）检测心肌酶乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenases, LDH）和激酶心脏同工酶（creatine kinase-MB, CK-MB）水平。
1.8 蛋白相互作用预测使用STRING数据库对cFLIP（又名cFLAR）进行蛋白相互作用预测，观察种群为“鼠”。评价指标为蛋白共表达、实验验证、数据库验证、数据挖掘以及蛋白同源，并获取相应的得分及总分，总分大于0.95的蛋白被认为是存在相互作用的蛋白并绘制成蛋白互作网络。
1.9 Western blot检测蛋白表达提取原代心肌细胞和心肌组织的蛋白标本后，使用SDS-PAGE凝胶试剂盒（中国塞维尔公司）配置不同浓度的分离胶和5%的浓缩胶并进行电泳，然后使用湿转法将蛋白转至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶进行封闭2 h，加入一抗（cFLIP、p-RIPK1、p-RIPK3、p-MLKL抗体均购自美国CST公司）于4℃孵育过夜，使用TBST洗膜3次后，加入二抗室温孵育2 h，使用TBST洗膜3次后，加入化学放光液进行显影。使用Image J 1.53软件（美国）测定蛋白条带的相对光密度，并以GAPDH（中国武汉三鹰公司）为内参计算相对蛋白表达。
1.10 统计学方法所有计量数据均以均数±标准差（
使用CCK-8检测各组心肌细胞活力，如图 1A结果显示，与Control组相比，H/R可显著下调心肌细胞活力，而与Ad-NC组相比，Ad-cFLIPL、Ad-cFLIPS以及Ad-cFLIPL+cFLIPS组的心肌细胞活力均被显著上调，且Ad-cFLIPL+cFLIPS组的心肌保护作用最佳。检测各组心肌细胞中cFLIP蛋白表达发现，与Control组相比，H/R显著下调了心肌细胞cFLIPL和cFLIPS的蛋白表达，转染Ad-cFLIPL、Ad-cFLIPS以及Ad-cFLIPL+cFLIPS可分别或同时上调cFLIPL和cFLIPS的蛋白表达，而转染Ad-NC对cFLIP蛋白表达无明显影响（见图 1B-D）。因此，该结果提示，H/R通过下调心肌细胞cFLIP蛋白表达并造成心肌细胞损伤，而过表达cFLIP可显著减轻H/R导致的心肌细胞损伤。
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| 与Control组相比，aP<0.05；与Ad-NC组相比，bP<0.05；与Ad-cFLIPL+cFLIPS组相比，cP<0.05 图 1 过表达cFLIP对H/R诱导心肌细胞损伤的作用 Fig 1 The effect of cFLIP overexpression on H/R-induced cardiomyocyte injury |
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使用DAPI/PI双染色检测心肌细胞坏死率，结果显示Control组中心肌细胞极少发生细胞坏死，而与Control组相比，H/R组的细胞坏死率明显增加。与Ad-NC组相比，过表达cFLIPL、cFLIPS以及cFLIPL+S均可显著减少坏死阳性细胞率。由于细胞坏死为细胞被动性死亡方式，不具有可调控性，而细胞程序性坏死具有细胞坏死相似的细胞表征，是受相关信号通路激活所介导的程序性细胞死亡方式。因此，该结果提示，H/R显著增加了细胞坏死的发生，其中部分细胞坏死是可被调控的程序性坏死，cFLIP可能是通过抑制程序性坏死相关信号通路，从而减少了细胞坏死的发生。见图 2。
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| 与Control组相比，aP<0.05；与Ad-NC组相比，bP<0.05；与Ad-cFLIPL+cFLIPS组相比，cP<0.05 图 2 过表达cFLIP对H/R诱导的细胞坏死率的影响（×100） Fig 2 The effect of cFLIP overexpression on H/R-induced cell necrosis rate(×100) |
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使用String数据库（https://string-db.org/）查找cFLIP（又称cFLAR）的蛋白互相作用网络发现，cFLIP与RIPK1和RIPK3具有直接蛋白作用关系，提示cFLIP可能对程序性坏死具有直接调控作用，见图 3A。如图 3B所示，使用Western blot检测程序性坏死相关蛋白的表达发现，与Control组相比，H/R损伤显著上调p-RIPK1、p-RIPK3以及p-MLKL蛋白表达。感染Ad-cFLIPL、Ad-cFLIPS以及Ad-cFLIPL+cFLIPS后发现，与Ad-NC组相比，过表达cFLIPL、cFLIPS以及同时过表达cFLIPL和cFLIPS均能显著下调p-RIPK1、p-RIPK3以及p-MLKL蛋白表达。且同时过表达cFLIPL和cFLIPS可较单独过表达cFLIPL和cFLIPS能更加显著地抑制RIPK1、RIPK3以及MLKL的蛋白磷酸化活化。以上结果证明，H/R可通过促进RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴的磷酸化活化，从而诱导心肌细胞发生程序性坏死，而过表达cFLIP可显著抑制H/R诱导的程序性坏死发生。
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| 与Control组相比，aP<0.05；与Ad-NC组相比，bP<0.05；与Ad-cFLIPL+cFLIPS组相比，cP<0.05 图 3 过表达cFLIP对程序性坏死相关蛋白活化水平的调控作用 Fig 3 The effect of cFLIP overexpression on the level of necroptosis-related proteins |
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构建大鼠MI/RI模型并检测各组心肌组织中cFLIP的蛋白表达变化及各组心肌梗死面积。如图 4所示，与Sham+Ad-NC组相比，I/R可显著下调cFLIPL和cFLIPS的蛋白表达并导致了(28.83±2.66)%的心肌梗死面积，而过表达cFLIP可显著缩小I/R导致的心肌梗死面积[I/R+Ad-cFLIPL组为（15.98±1.99）%，I/R+Ad-cFLIPS组为（17.45%±2.67）%，I/R+Ad-cFLIPL+cFLIPS组为(13.89+1.67)%，均P<0.05]。同样地，如图 4D-E所示，I/R显著升高了心肌损伤标志物CK-MB和LDH的水平，而过表达cFLIP可较I/R+Ad-NC组显著地降低CK-MB和LDH的水平。以上结果证明，过表达cFLIP可显著减轻由I/R所诱导的心肌损伤并缩小其导致的心肌梗死面积。
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| 与Sham+Ad-NC组相比，aP<0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP<0.05 图 4 过表达cFLIP对I/R导致心肌梗死面积的影响 Fig 4 The effect of cFLIP overexpression on I/R-caused myocardial infarction size |
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检测各组大鼠的心肌组织中程序性坏死相关蛋白的活化情况，如图 5结果所示，与Sham+Ad-NC组相比，I/R显著上调了RIPK1、RIPK3以及MLKL的磷酸化水平，而过表达cFLIPL、cFLIPS以及同时过表达cFLIPL和cFLIPS均可显著地降低RIPK1、RIPK3以及MLKL的磷酸化水平（均P<0.05）。该结果证明，过表达cFLIP可抑制RIPK1/RIPK3/MLKL介导的细胞程序性坏死。
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| 与Sham+Ad-NC组相比，aP<0.05；与I/R+Ad-NC组相比，bP<0.05 图 5 过表达cFLIP对I/R诱导的细胞程序性坏死的影响 Fig 5 The effect of cFLIP overexpression on I/R-induced necroptosis |
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MI/RI严重制约了AMI患者接受再灌注治疗后的临床获益，其发生过程涉及到炎症反应、氧化应激以及钙离子超载等病生理变化，导致心肌细胞发生坏死、凋亡、自噬以及程序性坏死等[10]。本研究结果证明，在心肌细胞H/R损伤和心肌组织I/R损伤过程中，cFLIPL和cFLIPS的蛋白表达均被显著下调，同时程序性坏死的相关蛋白RIPK1、RIPK3以及MLKL的磷酸化水平均显著上升。上调cFLIP的蛋白表达，可明显地减轻心肌细胞H/R损伤并缩小I/R导致的心肌梗死面积，DAPI/PI双染色结果提示过表达cFLIP减轻心肌损伤的机制与细胞坏死率降低有关。因此进一步检测程序性坏死相关蛋白发现，在心肌细胞H/R损伤模型和心肌组织I/R模型中，过表达cFLIP均可显著抑制了RIPK1、RIPK3以及MLKL的磷酸化水平。以上结果证明，MI/RI通过下调cFLIP的蛋白表达从而诱导程序性坏死的发生并导致心肌损伤，而过表达cFLIP可显著抑制程序性坏死的相关蛋白活化从而减轻心肌损伤并缩小心肌梗死面积。
cFLIP是Caspase-8和Caspase-10的同源蛋白，三者的基因序列均位于人类2q22-q34染色体上。cFLIP是维持胚胎发育及心脏功能稳态的重要蛋白，全基因敲除cFLIP将导致胚胎于发育的第10.5天左右死亡，其死亡原因主要是心脏发育不全，提示cFLIP是心肌细胞分化、生长的关键蛋白[11]。条件性敲除cFLIP也将显著增加T细胞、B细胞以及肝细胞对死亡诱导的敏感性，甚至发生自发性细胞死亡和大量炎症反应，这提示cFLIP是细胞程序性死亡和炎症反应的关键调节蛋白[12-13]。cFLIPL和cFLIPS的mRNA的启动子序列和终止子序列极其相似，仅CDS区相差789 bp，因此本研究并未使用PCR钓取目的基因，而是采用基因合成的方式获得目的基因序列。cFLIPL和cFLIPS都具有两个N端的两个DED，这使它们能够与RIPK1、RIPK3的DED结合并干扰死亡诱导复合物的形成，从而阻断程序性坏死的发生[14]。既往研究证明，过表达cFLIP可显著减轻脑缺血-再灌注损伤[15]以及永久性左前降支结扎[16]所导致的细胞损伤和炎症反应。此外，Stein等[17]发现缺血性预处理上调可cFLIPL和cFLIPS表达水平，并减轻MI/RI，以上研究提示过表达cFLIP具有心肌保护作用，然而cFLIP在MI/RI中的具体作用目前尚未被阐明。本研究结果证明，cFLIPL和cFLIPS蛋白表达均被体外H/R损伤和体内I/R损伤所下调，并伴有广泛发生的细胞坏死。过表达cFLIPL和（或）cFLIPS均可显著减轻心肌细胞H/R损伤和心肌组织I/R损伤，其机制与cFLIP靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL介导的程序性坏死有关。有趣的是，本研究发现cFLIPL和cFLIPS的共同过表达在体外提供了更加显著的心肌保护作用，这可能是因为Ad-cFLIPL+cFLIPS组的cFLIP蛋白总量高于其他两组。另外，Fricker等[18]证明，cFLIPS可以提高cFLIPL的敏感性以增强cFLIPL的蛋白结合力。然而，在动物I/R模型中，与单独过表达cFLIPL或cFLIPS相比，同时过表达cFLIPL和cFLIPS对心肌的保护作用差异无统计学意义，这可能与动物I/R模型中，心肌细胞还受到心脏以外的调控途径以影响心肌细胞的生物学功能，例如神经-体液调节[19]、外泌体的囊泡运输[20]以及冠脉微循环内皮细胞介导的一氧化氮释放[21]等均被证明可对MI/RI产生影响。
程序性坏死是一种受调节的坏死性细胞死亡，主要由RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴所介导，可导致细胞膜坏死性破裂。与凋亡和自噬的发生机制不同，由于程序性坏死相关蛋白均无蛋白水解酶活性，因此无法有效地降解细胞内大分子蛋白、受损细胞器以及炎性因子，导致大量具有免疫原性的物质经由破裂的细胞膜直接进入细胞外环境，引起大规模无菌性炎症[22]。在MI/RI过程中，炎症反应的发生具有两个高峰，第一个高峰由缺血期心肌坏死所引发，第二高峰由再灌注期心肌损伤所招募的中性粒细胞和巨噬细胞聚集所导致[23]。及时的开通冠脉和抑制程序性坏死的发生均可减弱MI后炎症反应，并促进炎症反应峰值提前，有助于改善AMI患者预后[24]。本研究使用细胞免疫荧光染色发现，过表达cFLIP可显著减少由H/R诱导的细胞坏死率，由于细胞坏死往往是被动发生的过程，而程序性坏死是信号传导通路诱导发生的主动死亡方式，因此笔者推测cFLIP主要通过抑制程序性坏死的发生从而减少细胞坏死率。使用STRING数据库预测cFLIP的蛋白相互作用关系发现，cFLIP与RIPK1和RIPK3可能具有直接蛋白相互作用，并进一步检测程序性坏死相关蛋白水平发现，过表达cFLIP可显著抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的磷酸化水平。以上结果证明，在MI/RI过程中，RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的活化介导了程序性坏死的发生，而过表达cFLIP可显著抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路的磷酸化水平，从而抑制程序性坏死的发生并减少心肌细胞坏死率，最终显著缩小MI/RI导致的心肌梗死面积。
总之，本研究证明了在MI/RI过程中cFLIPL和cFLIPS的蛋白表达下调与程序性坏死发生密切相关，过表达cFLIP可显著抑制RIPK1/RIPK3/MLKL介导程序性坏死发生，从而减轻心肌细胞损伤并缩小心肌梗死面积。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 刘滴、吴辉：研究设计、实验操作、论文撰写；杨俊、杨简、丁家望：论文审阅及修改；张静、李云曌：数据整理、统计分析；周刚、张栋：实验操作
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