2022, Vol. 31
2. 河南省急诊与创伤工程研究中心，郑州 450052
2. Emergency and Trauma Engineering Research Center of Henan Province, Zhengzhou 450052, China
急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是临床常见急腹症之一，发病率逐年增加，当其累积全身其他器官发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）时病死率高，是严重危害健康的重要疾病[1-2]。虽然近年来对SAP发病机制的认识逐渐提高，但目前仍没有公认的特异性治疗方法[3]。SAP的发病机制主要是由于胰酶激活引起的胰腺自身消化，炎症介质过度释放导致的系统性炎症反应以及氧化应激过程，因此抑制SAP过程炎症反应和氧化应激能够有效阻止其发生发展[4-5]。三基序蛋白家族（tripartite motif-containing, TRIM）在调控机体炎症、天然免疫、氧化应激、肿瘤进展等过程发挥重要作用[6]。TRIM27作为TRIM家族蛋白的一员，最初被鉴定为一个与RET原癌基因重排有关的基因[7]。本团队前期研究显示TRIM27能够显著抑制炎症反应，减轻小鼠肝脏缺血-再灌注损伤[8]，然而其在SAP中是否发挥作用尚未有研究报道。本研究拟通过建立小鼠SAP模型，探讨TRIM27对小鼠SAP的调控作用及其可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验试剂腺相关病毒购自汉恒生物科技（上海）有限公司，小鼠血清淀粉酶、脂肪酶及炎症因子ELISA试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司，小鼠胰腺组织氧化应激ELISA试剂盒购自南京建成科技有限公司，免疫组化试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司。p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-p65、p65一抗购自美国CST公司（美国，丹弗斯），二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 实验动物与模型制备24只SPF级雄性8周龄C57BL/6J小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（中国，长沙），所有动物实验均经郑州大学第一附属医院实验动物福利伦理审查委员会审查通过（编号：2019-KY-140）。所有动物通过随机数字法分为4组（每组n=6）：(1)假手术组+对照病毒组（AAV-GFP组），腹腔注射对照腺相关病毒（2×1011 μg/只）；(2)假手术组+过表达TRIM27组（AAV-TRIM27组），腹腔注射过表达TRIM27的腺相关病毒（2×1011 μg/只）；(3)SAP+对照病毒组（SAP+AAV-GFP组），腹腔注射对照腺相关病毒（2×1011 μg/只）4周后，腹腔注射L-精氨酸（L-Arg，Sigma，美国）两次（4 g/kg，间隔1 h）诱导SAP模型；(4)SAP+对照病毒组（SAP+AAV-GFP组）, 腹腔注射过表达TRIM27的腺相关病毒（2×1011 μg/只）4周后，腹腔注射L-精氨酸（L-Arg，Sigma，美国）两次（4 mg/kg，间隔1 h）诱导SAP模型。
1.3 标本采集造模后72 h后处死小鼠，通过摘取眼球法取血约1 mL，3 000 r/min离心10 min后将血浆冻存备用。将胰腺组织分为3份，1份放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片后行苏木精-伊红（HE）染色及免疫组化检测，另外2份放入液氮后转移至-80 ℃冰箱冻存。
1.4 血清及胰腺组织匀浆酶联免疫吸附试验（ELISA）取小鼠血浆及匀浆后的胰腺组织，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，采用相应的试剂盒根据说明书进行操作检测血清中淀粉酶（amylase, AMY）、脂肪酶（lipase, LIP）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白介素1b（interleukin-1b, IL-1b）、IL-6、巨噬细胞趋化蛋白-1（macrophage chemoattractant protein-1, MCP-1）以及胰腺组织中丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽（glutathione, GSH）表达。
1.5 胰腺组织切片HE染色将胰腺组织放入4%多聚甲醛中浸泡24 h后包埋制作蜡块，切片后进行脱水，采用全自动HE染色仪以苏木精染细胞核、伊红染细胞质，切片晾干后在光学显微镜下观察胰腺组织病理改变，参考Schmidt等[9]提出的方法，按水肿、坏死、炎症细胞浸润等病理改变，对胰腺病理损伤进行评分。
1.6 免疫组化检测胰腺组织中Ly6g阳性炎症细胞和髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）采用链菌素亲生物素-过氧化物酶法（SP法），严格按照试剂盒说明书操作。各组取胰腺组织石蜡切片，烤片后二甲苯脱蜡再水合，阻断内源性过氧化氢酶，胰蛋白酶抗原修复30 min，一抗4 ℃孵育过夜，二抗在室温摇床上孵育1 h。DAB显色染色后在光显微镜观察Ly6g和MPO表达。
1.7 蛋白印迹实验（Western blot）胰腺组织NFκB的表达采用RIPA试剂盒提取胰腺组织的总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白样本的浓度，将各组蛋白浓度调整为4 μg/μL。取5 µL样本点样进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后一抗4 ℃孵育过夜，二抗在室温摇床上孵育1 h，采用ECL发光液进行曝光，采用Image J软件对条带进行统计分析。
1.8 统计学方法通过SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，所有计量资料数据均满足正态分布，并表示为均数±标准差（x±s），两组间比较采用独立样本t检验，多组样本间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组小鼠TRIM27表达如图 1所示，与Sham组相比，小鼠SAP后胰腺组织中TRIM27表达显著下调，差异有统计学意义（P < 0.05）。与AAV-GFP组相比，AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中TRIM27表达显著上调，差异有统计学意义（P < 0.05）。
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| A：胰腺组织中TRIM27表达；B：胰腺组织中TRIM27表达；C：胰腺组织中TRIM27表达灰度值分析；D：胰腺组织中TRIM27表达灰度值分析；a为两组相比P < 0.05，差异有统计学意义 图 1 小鼠胰腺组织中TRIM27表达水平 Fig 1 Expression of TRIM27 in pancreas of mice |
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如图 2A和B所示，与AAV-GFP组相比，AAV-TRIM27组小鼠血清中AMY和LIP表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。与AAV-GFP组相比，SAP+AAV-GFP组小鼠血清中AMY和LIP表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与SAP+AAV-GFP组相比，SAP+AAV-TRIM27组小鼠血清中AMY和LIP表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。
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| A：血清AMY水平；B：血清LIP水平；C：血清IL-1b水平；D：血清IL-6水平；E：血清MCP-1水平；F：血清TNF-α水平；a为与AAV-GFP组相比P < 0.05；b为与SAP+AAV-GFP组相比P < 0.05 图 2 小鼠血清中AMY、LIP、TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1水平 Fig 2 Serum levels of AMY, LIP, TNF-α, IL-1b, IL-6, MCP-1 in mice |
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如图 2C~F所示，与AAV-GFP组相比，AAV-TRIM27组小鼠血清中TNF-α和IL-1b表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。与AAV-GFP组相比，SAP+AAV-GFP组小鼠血清中TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与SAP+AAV-GFP组相比，SAP+AAV-TRIM27组小鼠血清中TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 各组小鼠胰腺组织病理变化AAV-GFP组和AAV-TRIM27组小鼠胰腺结构完整，小叶结构清晰，没有明显差异。SAP+AAV-GFP组小鼠胰腺组织可见腺泡细胞水肿、片状坏死，周围大量炎症细胞浸润等损伤表现，病理评分较高。与SAP+AAV-GFP组小鼠相比，SAP+AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织腺泡细胞水肿、坏死明显减轻，炎症细胞浸润减少，病理评分明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
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| A：胰腺组织病理HE染色，标尺100 μm；B：胰腺组织病理水肿评分；C：胰腺组织病理炎症评分；D：胰腺组织病理坏死评分；E：胰腺组织病理总评分；黑色尖头标示水肿、红色箭头标示坏死，绿色箭头标示炎症；a为与AAV-GFP组相比P < 0.05，b为与SAP+ AAV-GFP组相比P < 0.05 图 3 各组小鼠胰腺组织HE染色及病理评分 Fig 3 Histopathological changes and pathological scores of the pancreas of mice |
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如图 4所示，与AAV-GFP组相比，AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中仅有极少量Ly6g和MPO阳性炎症细胞。与AAV-GFP组相比，SAP+AAV-GFP组小鼠胰腺组织中Ly6g和MPO阳性炎症细胞数量明显增多。与SAP+AAV-GFP组相比，SAP+AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中Ly6g和MPO阳性炎症细胞数量显著减少。
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| A：小鼠胰腺组织MPO阳性细胞免疫组化染色（标尺100 μm，×200）；B：小鼠胰腺组织Ly6g阳性细胞免疫组化染色（标尺100 μm，×200） 图 4 小鼠胰腺组织免疫组化染色 Fig 4 Immunohistochemistry of pancreatic tissue of mice |
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如图 5所示，与AAV-GFP组相比，AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中MDA、SOD、GSH表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。与AAV-GFP组相比，SAP+AAV-GFP组小鼠胰腺组织中MDA表达显著升高，SOD和GSH表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与SAP+AAV-GFP组相比，SAP+AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中MDA表达显著降低，SOD和GSH表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。
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| A：MDA表达水平；B：SOD表达水平；C：GSH表达水平；a为与AAV-GFP组相比P < 0.05；b为与SAP+AAV-GFP组相比P < 0.05 图 5 各组小鼠胰腺组织中MDA、SOD、GSH表达水平 Fig 5 The expression levels of MDA, SOD and GSH in pancreatic tissue of mice in each group |
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NFκB信号通路是机体调控炎症反应的经典通路，在SAP进展中同样发挥重要作用[10]。如图 6和7所示，与AAV-GFP组相比，AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中p-p65、p-ASK1、p-JNK、p-p38表达比较差异无统计学意义（P>0.05）。与AAV-GFP组相比，SAP+AAV-GFP组小鼠胰腺组织中p-p65、p-ASK1、p-JNK、p-p38表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与SAP+AAV-GFP组相比，SAP+AAV-TRIM27组小鼠胰腺组织中p-p65、p-ASK1、p-JNK、p-p38表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。
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| 图 6 各组小鼠胰腺组织中p-p65、p65、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK、p-p38、p38蛋白表达水平 Fig 6 Expression levels of p-p65, p65, p-ask1, ASK1, p-JNK, JNK, p-p38 and p38 proteins in pancreatic tissues of mice in each group |
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| A：各组小鼠胰腺组织中p-ASK1蛋白表达的统计分析；B：各组小鼠胰腺组织中p-p38蛋白表达的统计分析；C：各组小鼠胰腺组织中p-JNK蛋白表达的统计分析；D：各组小鼠胰腺组织中p-p65蛋白表达的统计分析；a为与AAV-GFP组相比P < 0.05；b为与SAP +AAV-GFP组相比P < 0.05 图 7 各组小鼠胰腺组织中蛋白表达水平的统计分析 Fig 7 Statistical analysis of protein expression in pancreatic tissue of mice in each group |
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SAP患者的典型表现为持续性器官衰竭，并伴有胰腺坏死或感染，在确诊后的前2周内有很高的死亡风险，总病死率超过40%[11]。目前虽然已有较多针对SAP的研究，但其机制尚未完全阐明，因此其诊治方法仍十分有限[12]。本研究通过建立小鼠SAP模型，并运用腺相关病毒过表达TRIM27发现，TRIM27过表达能够显著减轻小鼠SAP，并抑制小鼠SAP后的炎症反应和氧化应激。此外，TRIM27过表达能够显著抑制小鼠SAP后胰腺组织中NF-κB/MAPK信号通路的激活。
SAP导致的胰腺坏死可引发局部炎症，形成坏死-炎症的恶性循环，最终导致全身炎症反应综合征和器官衰竭[13-14]。炎症介质尤其是细胞因子在SAP的发生发展中起重要作用，研究报道SAP患者血液循环中存在大量炎症细胞因子。此外，研究者通过建立动物和细胞模型发现，胰腺腺泡细胞能够产生多种炎症介质，这些介质招募中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞等至胰腺，从而引起级联炎症反应，使脏器损害不仅局限于胰腺本身，常常累及到肝脏、肺脏、肾脏等多个脏器，严重时可发生全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭，甚至导致患者死亡[15-16]。研究报道，TRIM27能够通过下调P53通路显著抑制炎症反应[17]。本研究发现，小鼠SAP后血清中TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1等炎症因子表达显著升高，同时胰腺组织中Ly6g和MPO阳性的炎症细胞显著增多，而TRIM27过表达能够显著降低小鼠SAP后血清中TNF-α、IL-1b、IL-6、MCP-1水平，并减少胰腺组织中Ly6g和MPO阳性的炎症细胞浸润。以上结果证实TRIM27过表达能够显著抑制小鼠SAP过程炎症反应。
NFκB是机体经典的促炎信号通路，其参与多种炎症反应疾病的发病机制[18]。在急慢性炎症反应组织的免疫细胞和非免疫细胞中均可检测到NFκB通路的激活，其诱导促炎介质并维持炎症反应最终引起组织损伤[19]。NFκB信号通路与AP的发生发展过程密切相关，其激活导致胰腺组织损伤和局部炎症[20]。胰腺腺泡细胞中炎症级联反应在先天免疫反应开始前是由NFκB信号通路的激活引起。此外，NFκB的激活能够上调TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的表达[21]。研究报道，TRIM27通过抑制NFκB信号通路的激活抑制I型干扰素反应促进丙型肝炎病毒复制[22]。本研究发现，小鼠SAP后胰腺组织中NFκB通路蛋白p-p65表达显著上调，而通过腺相关病毒过表达TRIM27后，胰腺组织中NFκB通路的激活被显著抑制。这些结果表明在小鼠SAP过程中，TRIM27是NFκB通路的负调控因子。
氧化应激是AP发病机制中最重要的机制之一[23]。SAP过程的氧化应激主要由NADPH氧化酶和线粒体功能失调引起。NADPH氧化酶产生自由基不仅与活化中性粒细胞浸润有关，而且与腺泡细胞凋亡有关。在实验性AP中，胰腺中NADPH氧化酶的表达和活性增加，缺乏NADPH氧化酶的小鼠胰腺中雨蛙素诱导的胰蛋白酶活性明显减弱[24]。过氧化氢（H2O2）是NADPH氧化酶的第二信使，是炎症反应中ROS的主要来源。ROS通过白细胞的活化、迁移和粘附，以及通过增强其他介质（如细胞因子、趋化因子和粘附分子）的表达，发挥炎症介质的作用[25]。此外，在AP期间H2O2产生的ROS诱导NFκB信号通路的激活，并导致肺组织中中性粒细胞浸润介质P-选择素的上调。因此，抑制氧化应激能够显著减轻SAP的进展[26-27]。本团队前期已发表的文献同样发现，抑制氧化应激能够有效减轻小鼠SAP[28]。本研究发现，TRIM27过表达小鼠SAP后胰腺组织中促进氧化应激分子MDA表达显著下调，而抗氧化应激分子GSH、SOD表达显著上调。这些结果提示TRIM27过表达能够显著抑制小鼠SAP过程氧化应激。
目前越来越多研究聚焦MAPK信号通路在SAP中的作用[29]。MAPK信号通路由一套三级磷酸化依赖的激酶系统构成，包括MAPK、MAP2K和MAP3K，而MAPK激酶家族主要由ERK、p38、JNK等构成，全面参与细胞信号转导、炎症、氧化应激等过程[30]。研究报道，NADPH氧化酶的过度激活通过ROS介导的MAPK信号通路调控SAP大鼠的心功能不全和细胞凋亡[31]。此外，本团队前期研究已发现，TRIM27敲除可通过激活JNK/p38信号通路调控肝脏缺血-再灌注损伤[8]。本研究发现，小鼠SAP后胰腺组织中p-JNK和p-p38蛋白表达显著上调，而TRIM27过表达能够显著下调小鼠胰腺组织中p-JNK和p-p38表达。此外，本研究还发现TRIM27过表达可以显著抑制MAPK通路上游激酶ASK1的磷酸化激活。因此推测在SAP过程中TRIM27通过抑制ASK1-JNK/P38轴发挥保护作用。
综上所述，TRIM27是调控小鼠SAP的关键分子，其过表达能够显著抑制SAP过程的炎症反应和氧化应激。TRIM27过表达发挥SAP保护作用的机制可能是通过抑制NFκB/MAPK信号通路的激活实现。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 陈三洋：论文的设计、实施及论文撰写；宋耀东、崔宗超：动物实验；程波、刘艳娜：作图与统计分析；李孟可、梅超鹏、崔沪宁：分子生物学实验；朱长举：研究的总体设计及研究经费支持
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