自噬在急性肺损伤小鼠Treg/Th17细胞失衡中的作用研究

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王华兵, 董芳, 徐玲文, 揭凤英. 自噬在急性肺损伤小鼠Treg/Th17细胞失衡中的作用研究[J]. 中华急诊医学杂志, 2022, 31(11): 1476-1480. 复制到剪切板

Wang Huabing, Dong Fang, Xu Lingwen, Jie Fengying. The role of autophagy in the Treg/Th17 cell imbalance in mice with acute lung injury[J]. Chin J Emerg Med, 2022, 31(11): 1476-1480. 复制到剪切板

自噬在急性肺损伤小鼠Treg/Th17细胞失衡中的作用研究

王华兵 , 董芳 , 徐玲文 , 揭凤英

武汉市第三医院（武汉大学同仁医院）重症医学科, 武汉 430060

收稿日期: 2021-12-08

基金项目: 湖北省科技厅计划项目(2019CFB789);武汉市卫生健康委员会科研基金(WX21Z38)

通信作者: 王华兵, Email：chinawl2005@126.com.

摘要: 目的探讨自噬对急性肺损伤小鼠Treg/Th17细胞失衡的作用。方法 24只雄性SD小鼠随机分为假手术组(S组)、脓毒症组(Sep组)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(Sep+3-MA组)。采用脂多糖气管滴注法制备ALI模型。在光镜下评估小鼠肺组织病理学损伤评分并计算肺湿干质量比值（W/D），通过流式细胞术检测小鼠气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中Th17细胞和Treg细胞计数及其相关细胞因子的水平，用Western blot法测定BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62的表达。结果与S组比较，Sep组和Sep+3-MA组肺组织病理学评分、W/D比值升高（P < 0.05）；与Sep组比较，Sep+3-MA组BALF中Th17细胞计数下降，Treg细胞计数随着脓毒症的发展明显升高（P < 0.05），IL-17、IL-10和TNF-α的水平均明显下降（P < 0.05）；而TGF-β1的水平在脓毒症的早期升高，而随着脓毒症的发展，TGF-β1的水平明显下降（P < 0.05）。与Sep组比较，Sep+3-MA组小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3Ⅱ的表达呈下降趋势，但差异无统计学意义，Beclin-1表达则明显下降（P < 0.05），而p62的表达明显升高（P < 0.05）。结论异常激活的自噬参与了脓毒症急性肺损伤中Th17/Treg细胞的失衡，抑制自噬可恢复Th17细胞和Treg细胞的功能，使被打破了的平衡得到改善，通过抑制自噬改善Th17/Treg失衡可能成为调控脓毒症免疫紊乱的新思路。

关键词: 自噬急性肺损伤 Th17细胞 Treg细胞

The role of autophagy in the Treg/Th17 cell imbalance in mice with acute lung injury

Wang Huabing , Dong Fang , Xu Lingwen , Jie Fengying

Department of Critical Care Medicine, Wuhan City NO.3 Hospital(Tongren Hospital of Wuhan University), Wuhan 430060, China

Fund program: Project of Science and Technology Department of Hubei Province (No.2019CFB789); Research Foundation of Wuhan Municipal Health Commission (No.WX21Z38)

Corresponding author: Wang Huabing, Email: chinawl2005@126.com.

Abstract: Objective To investigate the effect of autophagy on the Treg/Th17 cell imbalance in mice with acute lung injury (ALI). Methods Twenty-four male SD mice were randomly divided into the sham operation group (S group), sepsis group (Sep group) and autophagy inhibitor 3-methyladenine group (Sep +3-MA group). ALI model was prepared by LPS tracheal dripping method. The mouse pathological injury score mice were evaluated under light microscopy and the W/D ratio was calculated. The counts of Th17 cells and Treg cells in tracheoalveolar lavage fluid (BALF) of mice and the levels of related cytokines were detected by flow cytometry. The expressions of LC3-Ⅱ, Beclin-1 and p62 in Th17 cells and Treg cells in BALF were determined by Western blot. Results CCompared with the S group, the lung histopathological score and W/D ratio of the Sep group and Sep+3-MA group increased (P < 0.05). Compared with the Sep group, the count of Th17 cells in BALF of the Sep +3-MA group decreased, while the count of Treg cells increased significantly with the progression of sepsis(P < 0.05), and the levels of IL-17, IL-10 and TNF-α were significantly decreased (P < 0.05). TGF-β1 levels increased in the early stages of sepsis, but decreased significantly with the progression of sepsis(P < 0.05). Compared with the Sep group, LC3-Ⅱ expression in BALF Th17 cells and Treg cells of the Sep+3-MA group showed a downward trend, but there was no statistical difference, while Beclin-1 expression significantly decreased (P < 0.05), and the expression of p62 significantly increased (P < 0.05). Conclusions Abnormal activation of autophagy in Th17 cells and Treg cells is involved in the immune imbalance of Th17/Treg cells in ALI with sepsis. Inhibition of autophagy can restore the functions of Th17 cells and Treg cells, and improve the imbalance of Th17/Treg by inhibiting autophagy may become a new idea to control the pathogenesis and progression of immune disorders with sepsis.

Key words: Autophagy Acute lung injury Th17 cells Treg cells

肺是脓毒症发生发展过程中最早且最容易受损的靶器官，急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是脓毒症多器官功能损害在肺部的表现。自噬（autophagy）是一个高度保守的、细胞内蛋白质或细胞器降解的过程，是维持机体内环境稳态的一种重要途径，研究表明，自噬参与了脓毒症的发生和发展^[1]。目前普遍认为自噬对细胞稳态和存活至关重要，自噬途径代表了一种主要的适应性反应, 以维持细胞和组织的动态平衡，以应对多种细胞应激^[2]。目前很多学者已经观察到多种肺部疾病中存在自噬活性的变化，越来越多的研究表明自噬与ALI之间存在密切关系^[3]，主要表现为自噬参与了ALI的内源性保护机制^[4]。Th17细胞和Treg细胞是ALI免疫紊乱发生与发展的重要调节细胞，自噬是否会影响Th17细胞和Treg细胞在ALI中的免疫紊乱过程，目前尚无系统研究报告，而这对研究自噬在ALI的发病机制及免疫紊乱反应有着重要的理论价值和临床意义。本研究以ALI小鼠模型为基础，评估自噬对ALI小鼠肺组织中Treg细胞和Th17细胞失衡的影响，为进一步研究自噬在ALI中的作用机制及临床应用提供新的理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠54只，雄性，6~8周龄，体重18~22 g，由武汉大学同仁医院（武汉市第三医院）动物实验中心提供。动物实验伦理委员会批准号为武三医实伦SY2019-030。

1.2 主要试剂和仪器

脂多糖内毒素（lipopolysaccharide, LPS）购自Sigma-Aldrich公司，白介素（interleukin, IL）-6、IL-10、IL-17、IL-23、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、TGF-β1、高迁移率族蛋白1（high mobility group protein 1, HMGBl）及单核细胞趋化蛋白-l（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）ELISA试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司，3-甲基腺嘌呤购自美国Bio Vision公司。

1.3 LPS-ALI模型制备

ALI模型依据文献[5]，采用LPS气管滴注法制备ALI模型。小鼠称重，各组小鼠均腹腔注射3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉，仰卧固定于实验台，颈部皮肤消毒，切开皮肤，逐层分离皮下组织，暴露气管。挑起气管, 除对照组外，其余各组小鼠气管内缓慢滴入2% LPS（2 mg/kg，30 μL），对照组滴入等量生理盐水。右颈动脉插管连接监护仪行持续动脉压监测。手术完毕后缝合手术切口，迅速将动物直立、旋转，使药液在肺内分布均匀。动物清醒后常规饲养。小鼠LPS-ALI模型复制成功标准：HE染色可见肺间质充血、水肿，肺泡间隔明显增宽，肺间质和肺泡腔内有大量炎症细胞浸润、出血，大量肺泡萎陷；动脉血气分析PaO₂/FiO₂≤300 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.4 实验分组及实验方法

采用随机数字表法分为3组（n=54只）：假手术组（S组）、脓毒症组（Sep组）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组（Sep+3-MA组），每组18只。3-MA组于术后1 h腹腔注射3-MA 15mg/kg。分别于6 h、12 h、24 h和48 h取2只小鼠，进行支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）细胞计数，同时留取肺组织待检。观察7 d生存情况：每组随机取10只小鼠，观察术后7 d生存情况，计算7 d生存率。

1.5 肺组织湿重∕干重比值（W/D比值）测定

小鼠处死后，取左肺下叶组织，称湿重后，将其置于80℃微波炉中烘48 h，然后取出称干重，计算W/D比值。肺损伤程度评分：取右肺组织4%多聚甲醛固定，脱钙剂脱钙72 h，逐级乙醇脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，切成4 mm的薄片，苏木精-伊红（HE）染色。在光学显微镜下观察肺组织病理形态学改变。每个标本观察5个视野。病理评分基于肺泡和间质水肿、炎症细胞浸润、出血。严重程度评分：无损伤计1分，损伤25%计2分，损伤50%计3分，损伤75%计4分，弥漫性损伤计5分。

1.6 BALF中Th17细胞和Treg细胞计数

分别于6 h、12 h、24 h和48 h取2只小鼠，麻醉后置于清洁的实验台上，打开胸腔，暴露肺和气管，气管切幵后插入软管并固定。通过软管注射PBS（pH值7.4）0.3 mL，静置30 s后回抽，共进行3次注射与回抽。将收集到的BALF 4℃ 1500 r/min离心10 min，离心半径10 cm，取上清液-20℃保存。BALF中细胞用PBS重悬，采用流式细胞仪计数Th17细胞和Treg细胞。采用直接计数法，以CD4PE（美国Cahag公司）设门，经CD25 FITC（美国Caltag公司）染色30 min。流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司，Epics-XL4）计数，全部数据经EXP032 ADC软件获取分析。ELISA检测气管BALF中IL-17、IL-10、TNF-a及TGF-β1水平：将BALF分离，取上清液，采用ELISA试剂盒（奥地利Bender Med Systems公司），按试剂说明书操作，使用BioTek全自动荧光酶标免疫测定仪进行检测IL-17、IL-10、TNF-a及TGF-β1水平。在操作前注意试剂盒冰箱取出后放置约20 min，以平衡至室温。

1.7 BALF中Th17细胞和Treg细胞内自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型（LC3Ⅱ）、Beclin-1及p62的表达

采用Western blot法测定BALF中Th17细胞和Treg细胞内自噬蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1及p62的表达：取BALF，加入细胞裂解液后匀浆、离心，取上清液测蛋白浓度。经SDS凝胶电泳，转至PVDF膜（美国Millipore公司）。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，洗膜后分别加入一抗LC3Ⅱ/（稀释度1∶100，美国Novus Biologicals公司）、Beclin-1（稀释度l∶500，美国BD Biosciences公司）、Rab7（稀释度1∶1 000，美国Novus Biologicals公司）和LAMP2（稀释度1∶500，英国Abcam公司），4℃孵育过夜；加入相应二抗，室温孵育1 h，暗室内显色，曝光，扫描。采用Gene Tools图像分析系统进行分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.8 统计学方法

统计使用SPSS 22.0软件处理，正态分布计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 7d生存情况

S组7 d生存率为100%，Sep组7 d生存率为0%，Sep+3-MA组7 d生存率为30%。与S组比较，Sep组7 d生存率降低（P < 0.05）；与Sep组比较，Sep+3-MA组7 d生存率升高（P < 0.05）。

2.2 各组小鼠肺组织病理学损伤评分及W/D比值

光镜下，S组肺泡结构未见明显异常，Sep组肺组织结构严重破坏，肺泡、肺间质充血明显，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内见大量中性粒细胞浸润及少量纤维蛋白渗出；Sep+3-MA组肺组织病理学损伤明显加重。与S组比较，Sep组和Sep+3-MA组肺组织病理学评分、W/D比值升高（P < 0.05）；与Sep组比较，Sep+3-MA组肺组织病理学评分、W/D比值升高，见表 1、图 1。

表 1 各组小鼠肺组织病理学损伤评分及W/D比值（x±s） Table 1 Lung histopathological injury score and W/D ratio of mice in each group (x±s)

组别	6 h	12 h	24 h	48 h
W/D(%)
S组	0.53±0.02	0.50±0.03	0.49±0.02	0.48±0.03
Sep组	0.66±0.05^a	0.69±0.04^a	0.63±0.03^a	0.62±0.04^a
Sep+3-MA组	0.72±0.02^ab	0.85±0.04^ab	0.75±0.02^ab	0.67±0.03^ab
肺损伤评分
S组	0.66±0.20	0.63±0.21	0.62±0.19	0.60±0.20
Sep组	5.28±0.25^a	5.49±0.23^a	5.23±0.22^a	5.16±0.20^a
Sep+3-MA组	6.33±0.18^ab	7.51±0.24^ab	6.64±0.21^ab	5.97±0.15^ab
注：与S组比较，^aP < 0.05；与Sep组比较，^bP < 0.05

表选项

图 1 各组小鼠12 h肺组织比较（HE×200 Fig 1 Comparison of 12 h lung tissue status of mice in each group (HE, original magnification×200)

图选项

2.3 各组小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞计数及其相关细胞因子的水平

与S组比较，Sep组Th17细胞计数升高，Treg细胞计数在脓毒症的早期下降，而随着脓毒症的发展，Treg细胞计数升高P < 0.05）；与Sep组比较，Sep+3-MA组Th17细胞计数下降，Treg细胞计数随着脓毒症的发展明显升高（P < 0.05）。与S组比较，Sep组IL-17、IL-10和TNF-α的水平均明显升高（P < 0.05）；而TGF-β1的水平在脓毒症的早期下降，而随着脓毒症的发展，TGF-β1的水平升高（P < 0.05）；与Sep组比较，Sep+3-MA组IL-17、IL-10和TNF-α的水平均明显下降（P < 0.05）；而TGF-β1的水平在脓毒症的早期升高，而随着脓毒症的发展，TGF-β1的水平明显下降（P < 0.05）。见表 2。

表 2 BALF中Th17细胞和Treg细胞计数及其相关细胞因子的水平（x±s Table 2 Th17 and Treg cell counts and their related cytokines levels in BALF (x±s)

组别	6 h	12 h	24 h	48 h
Th17细胞（%）
S组	1.12±0.07	1.21±0.09	1.18±0.06	1.16±0.05
Sep组	3.67±0.22^a	4.21±0.25^a	4.16±0.27^a	3.99±0.26^a
Sep+3-MA组	2.53±0.14^b	3.34±0.10^b	3.19±0.15^b	3.04±0.13^b
Treg细胞（%）
S组	6.47±0.52	6.32±0.10	6.49±0.43	6.51±0.64
Sep组	4.60±0.83^a	4.47±0.71^a	9.28±1.24^a	12.67±1.76^a
Sep+3-MA组	3.60±0.27^a	3.13±0.25^b	6.45±0.84^b	8.17±1.06^b
IL-17（pg/mL）
S组	7.49±0.76	7.41±0.72	7.56±0.83	7.58±0.77
Sep组	62.47±5.78^a	74.83±5.47^a	69.43±6.03^a	60.71±4.99^a
Sep+3-MA组	43.73±3.85^b	57.35±3.76^b	51.85±3.63^b	48.41±3.19^b
IL-10（pg/mL）
S组	2.36±0.32	2.53±0.27	2.85±0.28	2.96±0.31
Sep组	32.32±4.55^a	25.86±4.37^a	36.53±4.84^a	42.76±4.37^a
Sep+3-MA组	23.67±3.13^b	20.28±3.52^b	27.67±3.46^b	30.73±3.06^b
TNF-α（pg/mL）
S组	53.64±4.49	55.62±4.72	52.35±4.27	51.31±4.37
Sep组	531.37±47.23^a	476.44±34.19^a	379.18±31.83^a	325.62±27.52^a
Sep+3-MA组	863.27±87.56^b	724.36±71.62^b	563.27±57.81^b	487.34±41.38^b
TGF-β1（pg/mL）
S组	42.36±3.67	41.67±3.21	44.14±3.37	45.64±3.11
Sep组	28.67±2.87^a	25.39±2.20^a	56.24±4.88^a	67.49±5.48^a
Sep+3-MA组	39.13±3.32^b	35.37±3.01^b	52.29±4.63	60.39±5.13^b
注：与S组比较，^aP < 0.05；与Sep组比较，^bP < 0.05

表选项

2.4 各组小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3Ⅱ、Beclin-1和p62的表达

与S组比较，Sep组小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3Ⅱ和Beclin-1的表达明显升高（P < 0.05），p62的表达明显下降。与Sep组比较，Sep+3-MA组小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3Ⅱ的表达呈下降趋势，但差异无统计学意义，Beclin-1表达则明显下降（P < 0.05），而p62的表达明显升高（P < 0.05），见表 3、图 2和图 3。

表 3 各组小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3Ⅱ、Beclin-1和P62的表达 Table 3 Expression of LC3Ⅱ, Beclin-1 and P62 in Th17 cells and Treg cells in BALF of mice in each group

组别	6 h	12 h	24 h	48 h
Th17细胞内
LC3Ⅱ
S组	0.93±0.05	0.95±0.06	0.94±0.04	0.91±0.06
Sep组	1.36±0.17^a	1.64±0.21^a	1.58±0.19^a	1.55±0.16^a
Sep+3-MA组	1.32±0.14	1.47±0.13	1.45±0.16	1.44±0.14
Beclin-1
S组	1.03±0.07	1.07±0.08	0.98±0.7	0.97±0.05
Sep组	1.53±0.15^a	1.62±0.19^a	1.59±0.20^a	1.57±0.16^a
Sep+3-MA组	0.94±0.06^b	0.99±0.05^b	0.91±0.04^b	0.87±0.04^b
p62
S组	0.52±0.06	0.56±0.07	0.50±0.05	0.48±0.04
Sep组	0.43±0.04^a	0.46±0.05^a	0.39±0.03^a	0.36±0.03^a
Sep+3-MA组	0.56±0.05^b	0.58±0.05^b	0.52±0.04^b	0.50±0.03^b
Treg细胞内
LC3Ⅱ
S组	0.53±0.05	0.55±0.06	0.54±0.04	0.51±0.03
Sep组	0.82±0.08^a	0.88±0.09^a	0.85±0.07^a	0.83±0.06^a
Sep+3-MA组	0.81±0.07	0.85±0.06	0.83±0.05	0.81±0.03
Beclin-1
S组	0.73±0.05	0.77±0.07	0.72±0.05	0.70±0.05
Sep组	1.13±0.09^a	1.22±0.14^a	1.19±0.12^a	1.17±0.10^a
Sep+3-MA组	0.56±0.07^b	0.61±0.07^b	0.58±0.06^b	0.54±0.06^b
p62
S组	1.02±0.08	1.06±0.08	0.97±0.07	0.93±0.07
Sep组	0.93±0.08^a	0.99±0.11^a	0.95±0.07^a	0.92±0.06^a
Sep+3-MA组	1.36±0.13^b	1.42±0.14^b	1.32±0.14^b	1.27±0.11^b
注：与S组比较，^aP < 0.05；与Sep组比较，^bP < 0.05

表选项

图 2 Th17细胞内LC3Ⅱ、Beclin-1和P62的表达（12 h） Fig 2 Expression of LC3Ⅱ, Beclin-1 and P62 in Th17 cells (12 h)

图选项

图 3 Treg细胞内LC3Ⅱ、Beclin-1和P62的表达（12 h） Fig 3 Expression of LC3Ⅱ, Beclin-1 and P62 in Treg cells (12 h)

图选项

3 讨论

脓毒症是临床常见的危重症，而肺脏是脓毒症时易受损的靶器官之一，脓毒症导致的ALI或急性呼吸窘迫综合征是进展为多脏器衰竭的危险因素。严重脓毒症患者中有25%~50%并发ALI，而脓毒症所致的ALI病死率高达70%~90%。Th17细胞和Treg细胞是CD4⁺T淋巴细胞亚群，它们在维持机体免疫平衡过程中发挥重要作用，免疫相关性疾病和感染性疾病中均广泛存在Thl7/Treg细胞平衡失调。从目前对脓毒症研究的来看，Th17细胞的增高与患者的强烈的炎症反应状态有关^[6]，而Treg细胞的表达明显增加将导致患者免疫麻痹^[7]；而笔者前期对脓毒症大鼠的研究也表明，Th17细胞和Treg细胞参与了脓毒症免疫紊乱的过程^[8-9]。目前研究表明多种肺部疾病中存在自噬活性的变化，自噬与ALI之间存在密切关系，主要表现为自噬参与了ALI的内源性保护机制^[10]。自噬对脓毒症ALI免疫紊乱有着非常重要的影响，但其是否能通过影响Th17细胞和Treg细胞的失衡来影响脓毒症ALI的免疫紊乱过程，尚需进一步研究。

近年来，自噬被认为是维持T细胞稳态的重要环节，在T细胞介导的自身免疫性疾病中发挥着重要的作用。Beclin-1是哺乳动物参与自噬的特异性基因，可参与自噬体的形成，调控、促进自噬体的成熟，与自噬体的数量关系密切^[11]。LC3-Ⅱ和p62是监测自噬流的关键性标志^[12-13]。LC3-Ⅱ水平的增加表明自噬泡的形成，提示其合成增加或降解减少。p62是一个泛素结合的自噬受体和信号蛋白，它的聚积提示自噬-溶酶体通路障碍^[14]。本研究采用LPS气管滴注法制备ALI模型，通过3-甲基腺嘌呤处理后，在光镜下评估小鼠肺组织病理学损伤评分并计算W/D比值，通过流式细胞术检测小鼠BALF中Th17细胞和Treg细胞计数及其相关细胞因子的水平，Western blot法测定BALF中Th17细胞和Treg细胞内LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62的表达。本研究发现经过3-MA处理后，ALI小鼠肺部损伤情况早期明显加重，但随着脓毒症的发展，ALI小鼠肺部损伤情况减轻。BALF中Th17和Treg细胞中的LC3Ⅱ的表达呈下降趋势，但差异无统计学意义，Beclin-1表达则明显下降，而p62的表达明显升高，提示其胞内自噬被有效抑制。而有趣的是，3-MA处理后BALF中的Th17细胞比例下降，Treg细胞比例升高，且经ELISA检测，发现BALF中IL-17水平降低，TGF-β1水平升高，此结果表明，自噬对不同T细胞亚群产生的影响是不一致的。可能的解释为，自噬抑制剂会阻断Treg中关键转录因子Foxp3的降解，从而影响Treg细胞的分化及功能，通过自噬抑制剂抑制自噬可以重新恢复Th17/Treg免疫失衡。

目前，脓毒症淋巴细胞自噬多处于基础研究阶段，自噬如何从保护淋巴细胞转变为促进其凋亡未能阐述清楚，今后仍需要大量的基础和临床实验加以验证。在本项研究中，证实了异常激活的自噬参与了脓毒症ALI中Th17/Treg细胞的失衡，抑制自噬可恢复Th17细胞和Treg细胞的功能，使被打破了的平衡得到改善，通过抑制自噬改善Th17/Treg失衡可能成为调控脓毒症免疫紊乱的新思路。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 王华兵：研究设计、实验操作、论文撰写；董芳：研究设计、论文修改；徐玲文：实验操作；揭凤英：统计学分析

参考文献

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