2023, Vol. 32
2. 南京医科大学中毒研究所，南京 211166
2. Institute of Poisoning, Nanjing Medical University, Nanjing 211166, China
近半世纪以来，世界范围对于农药除草剂的使用量在不断增加[1]，其中联吡啶类除草剂以快速有效的除草特性而广泛高频使用。敌草快（diquat，DQ）自2016年国内销售增量后，逐渐成为临床上中毒病例高发的一种毒物[2-3]。
2020年发表于中华急诊医学杂志的《急性敌草快中毒诊断与治疗专家共识》提出了碳酸氢钠/连二亚硫酸盐试验作为敌草快中毒床边快速筛查技术的可行性[4]。该试验技术快速特异、可操作性强。既往，连二亚硫酸钠还原法在同属于联吡啶类化合物的百草枯中毒中得到临床充分应用[5-7]，但是尚未见这一快速筛查技术和敌草快中毒的疾病诊断、脏器损害及预后之间相关性的循证报道。另一方面，共识中引自国外文献的敌草快连二亚硫酸盐试验比色卡[4]，在应用实践中，存在中高浓度区间（≥300 μg/mL）比色卡浓度跨度大、颜色比对易产生误差的实际困难[3, 8]，不利于敌草快中毒后尿液浓度的判断。
本研究拟通过优化并标化敌草快尿半定量比色卡，应用于临床中毒病例后探索尿比色结果对于急性敌草快中毒的诊断、脏器损害以及预后等病情判断的临床价值。
1 资料与方法 1.1 一般资料本研究入组自2020年12月3日至2022年11月23日在本院急诊医学科救治的主诉敌草快中毒患者。排除标准：①毒检血、尿中均未检出敌草快者；②合并或单一其他毒物中毒患者；③非消化道暴露途径的中毒患者；④未行尿比色检测的中毒患者；⑤患者或监护人不同意参加本项目，拒绝签署知情同意书。期间敌草快中毒患者共103例，本研究排除：混合农药中毒9例，尿比色呈蓝色并经毒检确诊百草枯中毒19例，皮肤接触途径14例，肌肉注射途径1例，未行尿比色检测11例，最终纳入本研究的口服敌草快中毒患者49例。
1.2 研究方案本研究为单中心回顾性队列研究。统计入组患者基本信息、中毒相关临床资料、尿比色结果、血浆/尿液敌草快浓度、治疗经过如血液净化方案（血液灌流、血液透析、持续性血液净化等）、首次入院检查、脏器损伤及检验指标、ICU住院天数、总住院天数、临床结局等。其中，临床结局根据患者出院后随访结果决定。主要观察尿比色结果与血浆敌草快浓度相关性；另评价尿比色结果对靶器官损伤，及疾病预后的预测价值。本研究获南京医科大学第一附属医院伦理审核通过（伦理号：2022-SR-423）。
1.3 连二亚硫酸钠还原法 1.3.1 制作半定量比色卡将2 mL 5% NaCO3溶液倒入含1 g [9]连二亚硫酸钠粉（CAS Number: 7775-14-6）的Eppendorf管中，充分震荡后立即加入至10mL敌草快标准品（CAS Number: 6385-62-2）不同浓度的溶液（浓度分别为1 000 μg/mL、800 μg/mL、600 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL，和空白对照0 μg/mL，溶剂均为生理盐水），上下颠倒混匀后，即刻拍照记录颜色，参考国际通用标准色卡（PANTONE色卡）[9]，并记录色卡对应数值，根据数值制作半定量比色卡，见图 1。
留取患者入院时尿液10 mL，向尿液中加入2 mL 5% NaCO3溶液和1 g连二亚硫酸钠粉末，即刻观察尿液颜色变化，并与标准品建立的比色卡比对，由两位医务人员进行评估并分级。其中1级为患者尿液颜色肉眼观察反应前后无变化；若显色超过比色卡范围，定义原始尿液半定量比色等级为10级。
依据尿比色结果进行分组：1~3级为轻度浓度组，4~6级为中度浓度组，7~9级为重度浓度组，10级为暴发型浓度组。
1.4 生物样本定量检测患者入院时的血液和尿液样本同步送南京医科大学中毒研究所毒检中心进行生物样本敌草快定性定量检测，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS法），具体定量方案参考本团队前期发表的论文[10]。
1.5 脏器损伤定义中毒致中枢神经系统损伤的诊断依据为：患者出现意识障碍，同时影像学[头颅CT和（或）MRI]显示脑实质损害[11]；中毒致肾损伤定义为：患者出现少尿至无尿，伴随肌酐、尿素氮进行性升高[12]；中毒致肝损害定义为：血清酶学如丙氨酸氨基转氨酶、天门冬氨酸氨基转氨酶进行性升高[13]。中毒致消化道损伤包括上消化道损伤和下消化道损伤，上消化道损伤表现为口腔黏膜溃疡、破损出血、胃肠减压引出血性液体、胃潴留等；下消化道损伤表现为中毒性肠麻痹，腹内压增高，血便等[3]。
1.6 统计学方法应用SPSS 26.0软件进行统计学处理，近似服从正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用[M (Q1，Q3)]表示偏态分布的定量资料，分类变量用数字或百分比表示。对(x±s)资料进行ANOVA检验、对[M (Q1，Q3)]资料进行Kruskal-Wallis检验，对分类资料进行χ2检验或Fisher确切概法。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 入组患者一般情况49例急性口服敌草快中毒患者尿比色结果见图 2；尿比色结果与定量检测尿液敌草快浓度行Spearman相关性分析，两者相关性良好（相关系数r=0.89，P < 0.01），说明尿比色结果可行度高，见图 3。分组轻度组16例（32.6%），中度组9例（18.4%），重度组16例（32.6%），爆发组8例（16.3%）：表 1示患者口服剂量、血浆以及尿液敌草快浓度、暴露至尿半定量时间、初始检查中白细胞计数、中性粒细胞计数、血乳酸水平在各组尿比色结果之间差异有统计学意义（P < 0.05）。表 2示入组患者发生消化道损伤45例（91.8%），肾脏损伤35例（71.4%），肝脏损伤34例（69.3%），中枢神经系统损伤12例（24.4%）；中枢神经系统、肾脏、肝脏损伤以及临床结局在各组尿比色结果之间差异有统计学意义（P < 0.05）。
|
| 图 2 口服敌草快中毒患者尿比色结果 Fig 2 Urine colorimetric results of patients with oral diquat poisoning |
|
|
|
| 图 3 尿比色结果与尿液敌草快浓度相关性 Fig 3 Correlation between urine colorimetric results and urine DQ concentration |
|
|
| 指标 | 轻度(n=16) | 中度(n=9) | 重度(n=16) | 暴发型(n=8) | χ2值 | P值 |
| 基本信息 | ||||||
| 年龄（岁） | 36.0±18.2 | 35.3±19.5 | 30.7±10.5 | 26.4±8.6 | 0.23 | 0.88 |
| 男性（n, %） | 5(31.2%) | 6(66.7%) | 11(68.7%) | 6(75.0%) | 6.31 | 0.09 |
| 身高（cm） | 159.3±7.5 | 167.5±4.8 | 168.4±9.3 | 167.0±8.4 | 0.49 | 0.69 |
| 体重（kg） | 60.3±13.0 | 62.7±9.3 | 63.0±10.3 | 61.2±12.9 | 1.33 | 0.28 |
| 口服剂量（mL） | 20.0(5.0, 37.5) | 80.0(40.0, 140.0) | 100.0(50.0, 200.0） | 150.0(100.0, 390.0) | 26.02 | < 0.01a |
| 院前处理 | ||||||
| 洗胃（n, %） | 13(81.2%) | 8(88.9%) | 15(93.7%) | 8(100%) | 2.05 | 0.72 |
| 催吐/呕吐（n, %） | 15(93.7%) | 8(88.9%) | 14(87.5%) | 7(87.5%) | 0.97 | 1.00 |
| 血液净化（n, %） | 1(6.2%) | 1(11.1%) | 1(6.2%) | 0(0%) | 1.28 | 1.00 |
| 暴露至尿半定量时间（h） | 18.9±15.1 | 12.6±7.3 | 5.00±1.8 | 4.2±0.5 | 4.87 | 0.01a |
| 毒检情况 | ||||||
| 尿液浓度（ng/mL） | 450.5(30.8, 972.8) | 1323.2(1134.0, 2295.5) | 8231.9(4440.5, 26346.4) | 45089.8(9622.0, 53573.0) | 36.78 | < 0.01a |
| 血浆浓度（ng/mL） | 14.9(3.93, 68.4) | 140.0(57.5, 322.5) | 450.0(323.0, 1033.8) | 2019.0(1414.8, 2684.3) | 36.58 | < 0.01a |
| 入院首次检查 | ||||||
| WBC（×109/L） | 19.4±6.6 | 23.4±7.3 | 22.5±9.6 | 29.5±5.7 | 7.46 | < 0.01a |
| NE（×109/L） | 16.6±7.0 | 21.2±6.7 | 20.4±9.0 | 26.9±5.3 | 8.45 | < 0.01a |
| ALT（U/L） | 30.9(24.2, 66.1) | 45.3(27.0, 64.0) | 29.2(18.5, 210.6) | 43.7(19.1, 79.9) | 0.29 | 0.96 |
| AST（U/L） | 26.9(20.4, 42.1) | 48.4(31.2, 92.5) | 29.7(26.8, 229.55) | 50.2(34.4, 70.8) | 4.53 | 0.21 |
| Urea（mmol/L） | 4.2(3.7, 11.2) | 6.4(4.8, 10.3) | 5.0(3.9, 6.8) | 6.9(5.7, 8.3) | 4.24 | 0.24 |
| CREA（μmol/L） | 67.8(42.0, 299.2) | 128.1(78.4, 167.4) | 83.1(66.3, 115.1) | 109.1(94.9, 126.0) | 3.40 | 0.33 |
| Ccr（mL/min） | 128.1(38.1, 204.7) | 64.0(46.0, 87.6) | 94.0(53.1, 118.2) | 72.8(65.4, 90.3) | 5.68 | 0.13 |
| cTNT（ng/L） | 5.2(3.4, 30.2) | 7.8(4.3, 17.1) | 4.8(4.2, 19.2) | 7.9(5.7, 31.4） | 3.45 | 0.33 |
| Lac（mmol/L） | 0.9(0.6, 1.8) | 2.1(1.1, 4.8) | 2.7(1.2, 7.7) | 6.6(3.3, 7.5) | 18.18 | < 0.01a |
| 入院24 h尿量（mL） | 988.8±1382.2 | 840.0±970.4 | 1452.1±1193.5 | 390.0±246.0 | 2.03 | 0.12 |
| 注：WBC：白细胞计数；NE：中性粒细胞计数；ALT；丙氨酸氨基转氨酶；AST：天门冬氨酸氨基转氨酶；Urea：尿素氮；CREA：肌酐；Ccr：内生肌酐清除率；cTNT：高敏肌钙蛋白T；Lac：血乳酸；组间比较aP < 0.05。 | ||||||
| 指标 | 轻度(n=16) | 中度(n=9) | 重度(n=16) | 暴发型(n=8) | χ2值 | P值 |
| 脏器损伤 | ||||||
| 中枢神经系统（n, %） | 0(0.0%) | 2(22.2%) | 6(37.5%) | 4(50.0%) | 26.98 | < 0.01a |
| 肾脏（n, %） | 5(31.2%) | 8(88.9%) | 15(93.7%) | 7(87.5%) | 16.94 | < 0.01a |
| 肝脏（n, %） | 4(25.0%) | 8(88.9%) | 14(87.5%) | 8(100.0%) | 20.39 | < 0.01a |
| 消化道（n, %） | 12(75.0%) | 9(100.0%) | 16(100.0%) | 8(100.0%) | 5.84 | 0.05 |
| 住院天数（d） | 6.5(2.3, 11.5) | 17(3.5, 24.0) | 5.5(2.0, 13.8) | 2.0(1.0, 3.0) | 5.97 | 0.11 |
| ICU住院天数（d） | 0.0(0.0, 6.8) | 16.0(0.0, 22.5) | 2.5(0.0, 12.8) | 1.0(0.0, 2.8) | 3.91 | 0.27 |
| 预后死亡（n, %） | 1(6.2%) | 2(22.2%) | 8(50.0%) | 8(100.0%) | 22.37 | < 0.01a |
| 注：组间比较，aP < 0.05 | ||||||
将各组尿比色结果（轻度、中度、重度及暴发型）与血浆敌草快浓度进行Spearman相关性分析，发现两者存在显著相关性，相关系数r=0.89，P < 0.01。并进行线性回归得方程Y = 1.761*X + 0.9259，R2=0.74，见图 4。各组尿比色结果所对应的血浆敌草快浓度的95%预测区间为：轻度（8.5~25.3 ng/mL），中度（59.7~122.4 ng/mL），重度（334.5~739.5 ng/mL）及暴发型（1559.5~5370.7 ng/mL）。
|
| 图 4 各组尿比色结果与血浆敌草快浓度相关性 Fig 4 Correlation between urine colorimetric results and plasma DQ |
|
|
Kaplan-Meier生存曲线（图 5）示49例急性敌草快中毒患者存活30例（61.22%），死亡19例（38.78%）。其中尿比色结果轻度组病死率6.25%；中度组病死率22.22%；重度组病死率50.0%；暴发组病死率为100%。重度组和爆发组的中位生存时间分别为10 d和2 d。
|
| 图 5 敌草快中毒患者Kaplan-Meier生存曲线图 Fig 5 Kaplan-Meier of the probability of survival after diquat poisoning |
|
|
图 6示尿比色结果与患者临床预后的ROC曲线分析，尿比色结果对急性敌草快中毒死亡预后的诊断价值具有统计学意义（AUC=0.85，95%CI：0.74~0.97，P < 0.05）。尿比色结果对死亡预后诊断的临界值为4.5，敏感度：0.95，特异度：0.67，阳性预测值：64.2%，阴性预测值95.2%。故当尿比色结果≥5时，预示患者预后死亡风险显著增加。
|
| 图 6 尿比色结果预测预后的ROC曲线 Fig 6 ROC curve of urine colorimetric results for prognosis |
|
|
图 7示ROC分析结果表明，尿比色结果在预测敌草快致不同脏器损伤中具有同血浆/尿液浓度相近的准确性。尿比色结果预测消化道、肝脏、肾脏、及中枢神经系统损伤的临界值分别为2.5、3.5、3.5、5.5，即当尿比色结果≥3时，预示患者易发生消化道损伤；当尿比色结果≥4时，预示患者将造成急性肾损伤和肝脏损害；当尿比色结果≥6时，则预示存在中枢神经系统损伤风险。其中尿比色结果预测消化道损伤的敏感性最高（AUC 0.93，95% CI: 0.89~1.00），见表 3。
|
| （A）中枢神经系统（B）肾脏（C）消化道（D）肝脏 图 7 尿比色结果、口服剂量、尿液浓度和血浆敌草快浓度预测脏器损伤的ROC曲线 Fig 7 ROC curve of urine colorimetric results, oral dose, urine and plasma DQ concentration in the identification of organ damage |
|
|
| 脏器 | AUC | 95% CI | P值 | 临界值 | 灵敏度 | 特异度 | 阳性预测值 | 阴性预测值 |
| 消化道 | 0.93 | 0.85~1.00 | 0.01 | 2.5 | 100.0% | 88.6% | 100.0% | 40.0% |
| 肝脏 | 0.91 | 0.82~0.99 | < 0.01 | 3.5 | 80.0% | 90.9% | 90.9% | 75.0% |
| 肾脏 | 0.84 | 0.69~0.99 | < 0.01 | 3.5 | 78.6% | 88.2% | 90.9% | 68.7% |
| 中枢神经系统 | 0.78 | 0.65~0.92 | < 0.01 | 5.5 | 64.7% | 91.7% | 47.8% | 95.8% |
患者血/尿液中检出敌草快是诊断敌草快中毒的金标准，且血浆敌草快浓度往往作为评估中毒严重程度的重要指标。然而，在实际临床工作中，并不能即刻获得血浆敌草快浓度，也并非所有医疗机构可以完成相关毒物检测。敌草快中毒时为了能够快速判断患者实际摄入情况，可以通过连二亚硫酸钠半定量的快速实验，通过获得显色反应来半定量尿液中的敌草快浓度[3, 8]。
中毒患者的血浆敌草快浓度决定了治疗方案，尤其是否需要进行体外清除如血液灌流。本研究结果发现尿比色结果与患者血浆敌草快浓度之间存在线性相关。可通过快速获得尿比色结果，预测血浆敌草快浓度区间，从而为临床诊疗提供依据。
在尿半定量的临床运用中，会遇到敌草快暴露史明确且血液中存在较高浓度的患者，但尿比色结果在1~3级的轻度分组。在本研究中，9例尿半定量呈阴性结果的患者中，有1例患者自诉口服剂量≥50 mL，但初始尿比色结果为1级，实测尿液敌草快浓度也很低。该患者快速出现无尿，最终在暴露后48 h死亡。故尿半定量快速诊断实验存在“假阴性”结果。尿比色结果阴性的原因可能有两种：一种原因是实际口服剂量确实少。文献报道口服敌草快中毒患者，4%~11% 敌草快经肾脏排泄[3]，而当尿中敌草快浓度小于0.73 μg/mL，尿半定量显色肉眼不可分辨[8]；另一种原因是患者迅速发生的急性肾衰竭而造成的“假阴性”。敌草快是一种具有肾毒性作用的联吡啶基除草剂，中毒患者镜下显示肾小管坏死，而肾小球未受损[14-16]，脱落的肾小管上皮细胞堵塞肾小管，以及原尿经裸露的肾小管壁通过“反流”机制回吸收入血，导致肾小球滤过率显著下降和肾功能延迟恢复[15]。在一项体内研究中，当敌草快服毒时间超过24 h时，肾小管上皮细胞出现空化泡，部分线粒体双分子膜结构消失，支持细胞足突融合，基底膜致密沉积，溶酶体数量增加[17]。当患者自诉暴露剂量大于50 mL，暴露至尿半定量时间≥24 h，初始白细胞计数≥15×109/L，血肌酐达正常值3倍以上，乳酸≥2.0 mmol/L，往往提示已经发生了急性肾损害，而极可能造成尿半定量假阴性结果，必须警惕和慎重对待此类结果。本研究也存在一些不足之处：本研究为单中心研究，未能纳入其他地区和其他医疗机构的病例数据。回顾性研究中存在一定的信息缺失，本团队将进一步扩大样本量，在该方向继续进一步研究探讨。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 李锦泉：实验操作、数据收集及整理、论文撰写；毛征生：实验操作，研究指导；张劲松：研究设计，研究指导；王梓皓：实验操作；吴雨璇：实验操作；姜丽丽：实验操作；陈峰：研究指导；孙昊：研究设计，研究指导，论文修改
| [1] | Karpun NN, Yanushevskaya EB, Mikhailova YV, et al. Side effects of traditional pesticides on soil microbial respiration in orchards on the Russian Black Sea coast[J]. Chemosphere, 2021, 275: 130040. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.130040 |
| [2] | Dinis-Oliveira RJ, Duarte JA, Sánchez-Navarro A, et al. Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity, clinical features, and treatment[J]. Crit Rev Toxicol, 2008, 38(1): 13-71. DOI:10.1080/10408440701669959 |
| [3] | Magalhães N, Carvalho F, Dinis-Oliveira RJ. Human and experimental toxicology of diquat poisoning: Toxicokinetics, mechanisms of toxicity, clinical features, and treatment[J]. Hum Exp Toxicol, 2018, 37(11): 1131-1160. DOI:10.1177/0960327118765330 |
| [4] | 急性敌草快中毒诊断与治疗专家共识组. 急性敌草快中毒诊断与治疗专家共识[J]. 中华急诊医学杂志, 2020, 29(10): 1282-1289. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2020.10.002 |
| [5] | 田质光, 马洁, 赵义, 等. 尿中百草枯连续定性对百草枯中毒预后的判断[J]. 中华劳动卫生职业病杂志, 2014, 32(3): 221-222. DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-9391.2014.03.016 |
| [6] | 李恒, 谢文卿, 张萍, 等. 应用连二亚硫酸钠判断百草枯中毒的程度和预后[J]. 中华急诊医学杂志, 2010, 19(4): 361-364. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2010.04.008 |
| [7] | Koo JR, Yoon JW, Han SJ, et al. Rapid analysis of plasma paraquat using sodium dithionite as a predictor of outcome in acute paraquat poisoning[J]. Am J Med Sci, 2009, 338(5): 373-377. DOI:10.1097/MAJ.0b013e3181b4deee |
| [8] | Vohra R, Salazar A, Cantrell FL, et al. The poison pen: bedside diagnosis of urinary diquat[J]. J Med Toxicol, 2010, 6(1): 35-36. DOI:10.1007/s13181-010-0033-6 |
| [9] | Ren DD, Mei J, Bao J, et al. A novel profuse color card for convenient visual determination of iodide in human urine based on catalytic oxidation reaction[J]. J Pharm Biomed Anal, 2020, 191: 113580. DOI:10.1016/j.jpba.2020.113580 |
| [10] | Mao ZS, Wang X, Liu YD, et al. Simultaneous determination of seven alkaloids from Rhizoma Corydalis Decumbentis in rabbit aqueous humor by LC-MS/MS: application to ocular pharmacokinetic studies[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2017, 1057: 46-53. DOI:10.1016/j.jchromb.2017.04.040 |
| [11] | Dobbs MR. Toxic encephalopathy[J]. Semin Neurol, 2011, 31(2): 184-193. DOI:10.1055/s-0031-1277989 |
| [12] | Okusa MD, Davenport A. Reading between the (guide)lines: the KDIGO practice guideline on acute kidney injury in the individual patient[J]. Kidney Int, 2014, 85(1): 39-48. DOI:10.1038/ki.2013.378 |
| [13] | Polson J, Lee WM, American Association for the Study of Liver Disease. AASLD position paper: the management of acute liver failure[J]. Hepatology, 2005, 41(5): 1179-1197. DOI:10.1002/hep.20703 |
| [14] | Hantson P, Wallemacq P, Mahieu P. A case of fatal diquat poisoning: toxicokinetic data and autopsy findings[J]. J Toxicol Clin Toxicol, 2000, 38(2): 149-152. DOI:10.1081/clt-100100930 |
| [15] | 张华忠, 孙昊, 陈旭锋, 等. 敌草快中毒致急性肾损伤肾活检2例报道[J]. 中华急诊医学杂志, 2022, 31(8): 1121-1123. DOI:10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2022.08.018 |
| [16] | Wang DQ, Zhang GZ, Zhang WW, et al. Successful extracorporeal membrane oxygenation support for severe acute diquat and glyphosate poisoning: a case report[J]. Medicine (Baltimore), 2019, 98(6): e14414. DOI:10.1097/MD.0000000000014414 |
| [17] | Wu YZ, Cui SQ, Wang WJ, et al. Kidney and lung injury in rats following acute diquat exposure[J]. Exp Ther Med, 2022, 23(4): 275. DOI:10.3892/etm.2022.11201 |