肾缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）是急性肾损伤（acute kidney disease, AKI）最常见的病因，常发生于肾移植后、脓毒症、低血容量性休克等，是成人住院死亡的重要原因之一^[1-2]。在肾脏IRI过程中，大量活性氧（reactive oxygen, ROS）产生，激活氧化应激，引起组织损伤。AKI是慢性肾脏病（chronic kidney diseases, CKD）的危险因素之一，AKI进展至CKD给个人、家庭及社会带来沉重的医疗负担^[3-4]，但AKI向CKD转变的机制目前尚不明确。

硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein, TXNIP）又称维生素D3上调蛋白1（vitamin D3-upregulated protein 1, VDUP-1）^[5]。当细胞内存在大量ROS时，TXNIP从细胞核移位至线粒体，促使TRX2和凋亡信号调节激酶1（apoptosis Signal Regulating Kinase 1, ASK1）解离，从而引起线粒体相关凋亡^[6]。本课题组前期研究发现，肾脏发生IRI时，肾组织TXNIP表达明显上调，敲除TXNIP可明显减轻细胞凋亡，这些提示TXNIP参与了肾脏IRI早期损伤^[7]。但TXNIP激活对肾IRI的长期影响尚无报道。

肾间质纤维化是多种慢性肾脏病的共同通路^[8]。NOD样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3, NLRP3）是调节无菌炎症的关键通路，它可以被ROS等多种损伤模式分子激活，参与器官纤维化过程^[9-12]。既往研究发现，TXNIP被ROS激活后，能结合并激活NLRP3，释放大量促纤维化因子^[13]。因此，本研究推测，肾脏IRI时大量ROS可激活TXNIP/NLRP3通路，促进肾间质炎症和纤维化，诱导AKI向CKD转变。

6~8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。TXNIP基因敲除鼠（遗传背景为C57BL/6J）由河北医科大学病理教研室馈赠。所有动物在河北省人民医院动物中心屏障性饲养1周后进行实验，小鼠常规饲料喂养，光照12 h，黑暗12 h。根据实验需要，野生型鼠随机分为假手术组（Sham）、肾IRI组（IRI），每组12只；TXNIP基因敲除鼠随机分为Sham+TXNIP KO组、IR+TXNIP KO组，每组12只。本研究经河北省人民医院实验动物伦理委员会审核并通过，伦理编号：（2019）科伦审第（43）号。

兔来源一抗TXNIP、NLRP3、Pro-白介素（Interleukin, IL）-1β、IL-1β、α-SMA、GAPDH购买自Abcam公司（剑桥，英国），HRP标记的羊抗兔二抗购买自博士德生物工程有限公司（武汉，中国）。小鼠血肌酐、尿素氮、肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1, Kim-1）、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）、IL-6等ELISA检测试剂盒购买自酶联生物科技有限有限公司（上海，中国）。Hiscript Ⅲ Reverse Transcriptase、ChamQ SYBR qPCR Master Mix购买自诺唯赞医疗科技有限公司（南京，中国）。RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司（上海，中国）。

肾IRI模型：小鼠术前12 h禁食、不禁水。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。取仰卧位，脱毛、消毒，无菌纱布覆盖非手术区域。沿腹中线打开腹腔，将肠管推向胸部，暴露、游离两侧肾蒂，动脉夹夹闭双侧肾蒂，肾脏由红色变成紫黑色表示夹闭成功。45 min后松开动脉夹，使肾脏重新恢复血流灌注，肾脏由紫黑色转变为粉红色说明再灌注成功。青霉素生理盐水冲洗腹腔，补充200 µL温热的生理盐水，关腹、消毒切口。假手术模型游离两侧肾蒂，不进行夹闭，其余操作相同。

肾IRI小鼠建模前经球后静脉丛采集静脉血，留取随机尿。模型建成后第1天、第7天和第28天同样方法留取血清和尿液。模型建成后第1天和第28天分别取6只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，经心脏灌注生理盐水后取两侧肾脏，切取肾皮质。1/4肾皮质用4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片，进行Masson染色，肾小管损伤和肾间质纤维化评估方法参照文献^[14]。1/4肾皮质分离后立即加入Trizol裂解，提取总RNA，逆转为cDNA，qPCR检测TGF-β、IL-6、GAPDH mRNA相对表达水平，各基因引物序列见表 1。1/4肾皮质称重后加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂），匀浆器充分研磨，冰上裂解30 min，14 000 g离心15 min，取上清用于TXNIP、NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA、GAPDH等Western Blot检测。以GAPDH为内参照，以Sham组目的蛋白与GAPDH灰度值比值的平均值为标准进行归一化，得到各组目的蛋白相对表达水平，用于后续统计学分析。1/4肾皮质组织进行重量，加入9倍体积PBS充分研磨，将研磨液以5 000 g离心10 min，得到上清液用于检测MDA和SOD。

应用GraphPad 9.0和SPSS 21.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，方差齐的多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

如表 2和表 3所示，IRI后第1~28天，与Sham组和Sham+TXNIP KO组相比，IRI组和IRI+TXNIP KO组小鼠血肌酐、尿素氮、尿Kim-1和NGAL均有明显升高（均P < 0.05），呈现先升高，后下降趋势。IRI+TXNIP KO组小鼠血肌酐、尿素氮、尿Kim-1和NGAL水平始终低于IRI组（均P < 0.05）。

如表 4所示，IRI后第28天，IRI+TXNIP KO组肾组织MDA水平明显低于第1天；IRI+TXNIP KO组MDA水平低于IRI组，与Sham+TXNIP KO组相当（P > 0.05），IRI组仍高于Sham组（P < 0.05）。

IRI后第28天，IRI组和IRI+TXNIP KO组肾组织SOD水平明显高于第1天；IRI+TXNIP KO组SOD水平高于IRI组，与Sham+TXNIP KO组相当（P > 0.05），IRI组仍低于Sham组（P < 0.05）。

如表 5所示，与Sham组和Sham+TXNIP KO组相比，IRI后第1~28天，IRI组和IRI+TXNIP KO组小鼠血清TGFβ和IL-6均有升高，呈现先升高，后下降趋势。IRI+TXNIP KO组小鼠血清TGFβ和IL-6水平始终低于IRI组（均P < 0.05）；第28天，IRI+TXNIP KO组小鼠血清TGFβ和IL-6水平与Sham+TXNIP KO组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。

对肾组织炎症因子进一步分析（图 1），IRI后第28天，IRI组和IRI+TXNIP KO组肾组织TGF-β和IL-6相对表达量明显低于第1天，IRI+TXNIP KO组TGF-β和IL-6相对表达量低于IRI组（P > 0.05）。

两组间比较，aP < 0.05，bP < 0.01；与第1天比较，cP < 0.05 图 1 肾IRI小鼠肾组织炎症因子TGF-β（A）和IL-6（B）相对表达量 Fig 1 The relative expression levels of TGF- β (A) and IL-6 (B) of kidney in mice with renal ischemia-reperfusion injury

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图 2 Masson染色显示，IRI后第1天，IRI组和IRI+TXNIP KO组小鼠肾小球周围和肾间质可见明显蓝染的纤维化成分和炎症细胞浸润，肾小管坏死、萎缩。IRI组小鼠肾组织纤维化和炎症细胞浸润均明显强于IRI+TXNIP KO组。IRI组和IRI+TXNIP KO组第28天，肾间质纤维化范围较第1天继续增加，但IRI+TXNIP KO组纤维化范围小于IRI组。

图 2 TXNIP对肾IRI小鼠肾组织病理损伤的影响（Masson染色，×400） Fig 2 The effect of TXNIP on renal pathological damage in mice with renal ischemia-reperfusion injury (Masson, original magnification×400)

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对肾小管-肾间质损伤进行量化评分（表 6），IRI后第1天，IRI组和IRI+TXNIP KO组肾组织肾小管损伤评分和肾间质纤维化评分明显高于Sham组和Sham+TXNIP KO组（P < 0.05），IRI+TXNIP KO组肾小管损伤和肾间质纤维化评分低于IRI组（P < 0.05）。IRI组和IRI+TXNIP KO组第28天肾组织肾小管损伤评分明显低于第1天（P < 0.05），高于Sham组和Sham+TXNIP KO组（P < 0.05）。IRI组第28天肾间质纤维化评分明显高于第1天（P < 0.05）；IRI+TXNIP KO组与第1天相比有升高，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

图 3 Western Blot结果显示，IRI后第28天，IRI组和IRI+TXNIP KO组肾组织NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA蛋白相对表达量明显低于第1天，但高于Sham组和Sham+TXNIP KO组（P < 0.05）。在IRI后第1天和第28天，IRI+TXNIP KO组NLRP3、Pro-IL-1β、IL-1β、α-SMA蛋白相对表达量明显低于IRI组。

A：第1天肾皮质TXNIP/NLRP3通路蛋白表达；B：第28天肾皮质TXNIP/NLRP3通路蛋白表达；C：A和B中蛋白相对表达量的统计图；两组间比较，aP < 0.01；与第1天比较，bP < 0.05 图 3 TXNIP对肾IRI小鼠肾组织NLRP3通路的影响 Fig 3 The effect of TXNIP on NLRP3 pathway in mice with renal ischemia-reperfusion injury

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流行病学研究显示近年来全球慢性肾脏病影响全球超过10%的人口，这种影响在中等收入国家更为严重^[15]。现在已经明确急性肾损伤是CKD的直接病因^[16]。临床上，AKI治疗一直以对症支持治疗为原则，无减轻肾组织损伤、防止肾脏纤维化的有效手段。在本研究发现TXNIP敲除可减轻肾脏IRI后早期和长期MDA水平升高，恢复SOD水平，抑制NLRP3信号通路活化，削弱血清和肾组织炎症因子的增高，改善肾功能，减轻肾脏纤维化。

肾纤维化是所有慢性肾脏病的共同终末通路。近年来研究发现，严重的、持续不缓解的、或没有及时干预的肾IRI会启动肾小管间质纤维化。本研究发现野生型小鼠诱导肾IRI 1 d时，除了血肌酐、尿素氮和肾小管损伤标志物Kim-1和NGAL水平升高，肾间质出现了明显的胶原纤维成分蓄积，同时伴有氧化应激和炎症因子水平增加。在Xiao等^[17]研究中，肾IRI初始阶段，Masson未见明显胶原纤维沉积时，PCR检测到了FN、α-SMA等基因表达增加。这些结果提示纤维化可发生在IRI早期，需要及时发现和干预IRI，避免肾纤维化范围持续扩大。

TXNIP已经被证明促进了癌症、糖尿病、神经系统疾病、自身免疫病等多种疾病进展。本研究发现TXNIP敲除小鼠诱导肾IRI时，肾脏早期损伤明显减轻，血肌酐、尿素氮和肾小管损伤标志物Kim-1和NGAL水平明显低于野生型小鼠，Masson染色显示肾间质蓝染的纤维物质蓄积明显减少，同时血清炎症因子TGFβ和IL-6也呈现下降。本研究还发现，TXNIP敲除带来的保护效应一直持续到了肾脏恢复再灌注后28 d，肾损伤标志物等持续下降，NGAL、MDA、SOD、TGF-β、IL-6、α-SMA和肾间质纤维化评分等虽然仍高于Sham组，但差异无统计学意义。He等^[18]的研究发现，老年小鼠敲除TXNIP基因后，衰老相关纤维化表型明显减轻，与本研究结果相似。因此认为TXNIP参与肾IRI后肾脏慢性纤维化，靶向TXNIP可延缓肾脏纤维化进展。

炎症因子是促进AKI向CKD转变的重要因素，本研究也发现TXNIP敲除可显著降低肾IRI小鼠早期和长期炎症因子水平。NLRP3信号通路在炎症因子表达中扮演着重要作用，也是连接氧化应激和炎症的桥梁^[19]，因此探索了TXNIP对NLRP3通路的影响。本研究发现TXNIP敲除阻止了早期和长期NLRP3及其下游Pro-IL-1β和IL-1β蛋白的表达，进而抑制了炎症因子和α-SMA表达，提示NLRP3在TXNIP下游发挥作用。许多研究也证实，靶向调节TXNIP/NLRP3相互作用可减轻肠道IRI、肝损伤等^[20-21]。因此，TXNIP/NLRP3相互作用可能是减轻AKI、抑制AKI向CKD转变的潜在治疗策略。

本研究尚存在以下限制。第一，对肾IRI诱导肾纤维化观察时间范围较窄，缺乏对小鼠预后的研究；第二，TXNIP和NLRP3相互作用的结构基础未进行研究，这限制了进一步的药物开发；第三，不排除TXNIP通过其他通路减轻肾脏损伤。

综上所述，本研究证实了抑制TXNIP显著减轻IRI，抑制AKI向CKD转变，其机制可能是通过抑制NLRP3通路持续激活，降低了全身和肾脏局部炎症因子水平，减轻α-SMA等纤维化成分在肾间质蓄积。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明   李冠青：动物实验、数据收集及整理、论文撰写；张亚洲：工作支持、研究设计；田志：指导统计学分析；王旻：论文修改