2023, Vol. 32
创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是导致死亡和残疾的重要原因之一[1]，仅在美国每年就约有200万人因各种原因导致TBI，造成严重的经济损失[2]。TBI引发的脑损伤主要包括原发性脑损伤和继发性脑损伤，原发性脑损伤常造成结构性破坏，继发性脑损伤常伴随炎症反应、线粒体损伤、内质网应激和细胞凋亡，对脑组织造成进一步损伤[3-4]。其中，线粒体损伤和内质网应激已成为TBI治疗的研究热点。根据相关研究，线粒体和内质网应激对调节由TBI引起的细胞凋亡至关重要[5]。TBI可使线粒体去极化，释放凋亡诱导因子，增加线粒体裂变，引起膜电位下降，进一步造成细胞凋亡[6]。TBI增加内质网应激，上调葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78, GRP78）、增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）、蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）等相关蛋白表达水平，并造成细胞凋亡[7]。当前治疗继发性脑损伤的药物主要包括生长因子、钙离子阻滞剂、自由基去除剂等，但治疗效果有限，研发治疗TBI的有效药物至关重要。唑尼沙胺（zonisamide, ZNS）作为抗癫痫药物，在日本已被批准作为左旋多巴治疗帕金森病的辅助药物，其可通过多种机制对帕金森病治疗产生有益作用[8-9]。ZNS能通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）在体内和体外模型中减少内质网应激诱导的神经元细胞凋亡[10]。目前国内外对ZNS与TBI模型之间的关系报道较少，ZNS是否通过保护线粒体和抑制内质网应激等机制保护TBI糖氧剥夺细胞模型仍有待研究。
因此，本团队用人神经母细胞瘤（human neuroblastoma cells, SH-SY5Y）细胞建立最常见的TBI体外细胞模型——OGD模型[11]，探讨ZNS对OGD后SH-SY5Y细胞的作用及机制，为ZNS保护TBI糖氧剥夺细胞模型提供新的实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验细胞及分组SH-SY5Y细胞购自上海Sciencell公司，将细胞培养于含有10%胎牛血清（FBS）和1%双抗（青霉素、链霉素）的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）中，并放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。取第4代SH-SY5Y细胞按3×105/孔密度接种至6孔板中。按照随机数字表法将细胞分为三组：对照组（Control组），OGD组，给药组（OGD+ZNS组）。
1.2 主要试剂试剂包括胎牛血清（Sciencell公司，中国上海），磷酸盐缓冲液（PBS，Sciencell公司，中国上海），胎牛血清（FBS，Sciencell公司，中国上海），青霉素-链霉素（Hyclone公司，中国上海），DMEM（Hyclone公司，中国上海），ZNS（Sigma公司，中国上海），CCK-8试剂盒（碧云天生物技术公司，中国上海），乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（碧云天生物技术公司，中国上海），β-半乳糖苷酶试剂盒（碧云天生物技术公司，中国上海），线粒体红色荧光探针（碧云天生物技术公司，中国上海），JC-1线粒体膜电位试剂盒（碧云天生物技术公司，中国上海），ATP试剂盒（碧云天生物技术公司，中国上海），葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、蛋白二硫键异构酶（PDI）以及内参β-肌动蛋白（β-actin）（Abcam公司，中国上海）。
1.3 OGD模型建立取正常培养的SH-SY5Y细胞，将培养基换成不含糖的DMEM中，放入装有含5% CO2和95% N2的厌氧室中6 h，糖氧剥夺后取细胞，将培养基换成普通培养基放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养12 h，进一步实验检测[12]。给药组在OGD处理前向培养基中加入浓度为100 μmol/L[13]的ZNS预处理2 h，后续步骤与OGD组相同，对照组在普通培养基及37 ℃、5% CO2培养箱中培养，进一步实验检测。
1.4 观察和检测指标 1.4.1 细胞存活率检测SH-SY5Y细胞以1×104/孔密度接种至96孔板中，并放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h。根据实验设计用不同方式处理三组细胞，处理后将培养基换成100 μL含10 μL CCK-8试剂的培养基在培养箱中孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，计算细胞存活率。
1.4.2 细胞LDH释放率检测SH-SY5Y细胞以1×104 /孔密度接种至96孔板中，并放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，使待检测时细胞密度不超过80%~90%，根据实验设计用不同方式处理三组细胞，处理后向培养基中加入10 μL LDH释放试剂，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育1 h。到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400 r/min离心5 min。分别取各孔的上清液120 μL，加入到一新的96孔板相应孔中，各孔分别加入60 μL LDH检测工作液，混匀，室温（约25℃）避光孵育30 min（可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动），用酶标仪测定在490 nm处的吸光度，计算LDH释放率。
1.4.3 β-半乳糖苷酶染色观察细胞衰老取培养于6孔板不同处理的三组SH-SY5Y细胞，吸除细胞培养液，用PBS洗涤细胞，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。37 ºC孵育过夜，用保鲜膜封住6孔板防止蒸发。普通光学显微镜下观察细胞染色及衰老情况。
1.4.4 Mito Tracker Red染色观察线粒体形态变化取培养于6孔板不同处理的三组SH-SY5Y细胞，吸除细胞培养液，用50 nmol/L Mito-Tracker Red孵育细胞20 min，PBS洗涤细胞，用4%多聚甲醛中固定20 min，0.2% Triton X-100透10 min，然后用DAPI染色细胞核7 min，激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态变化。
1.4.5 线粒体膜电位检测取培养于6孔板不同处理的三组SH-SY5Y细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞，加入1 mL细胞培养基，加入1 mL JC-1染色工作液，充分混匀，放入细胞培养箱中37 ºC孵育20 min，孵育结束后，吸除上清液，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入2 mL细胞培养基，激光共聚焦显微镜下观察线粒体染色情况。
1.4.6 细胞ATP浓度检测取培养于6孔板不同处理的三组SH-SY5Y细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞，按照6孔板每孔加入200 μL裂解液，用移液器进行反复吹打或晃动培养板使裂解液充分接触并裂解细胞。裂解后离心机4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液，用于后续的测定。将反应液加入96孔板（100 μL/孔）中，室温孵育5 min，取上清液加入96孔板中，快速混合，使用化学发光检测仪检测细胞ATP浓度。
1.4.7 Western blot法检测内质网应激相关指标GRP78、CHOP、PDI以及内参β-actin的表达变化取培养于6孔板不同处理的三组SH-SY5Y细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞，加入裂解液，收集入离心管中，放入离心机，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液，二喹啉甲酸（BCA）法检测蛋白浓度。取从SH-SY5Y细胞中提取总蛋白质，蛋白质样品用于在10%~15% SDS-PAGE上在80 Ⅴ下电泳20 min，120 Ⅴ下电泳60 min，在300 mA下转移至PVDF膜上90 min，膜室温下用5%脱脂牛奶封闭120 min，加入一抗4 ℃孵育过夜：GRP78（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）、PDI（1∶1 000），复温20 min后，膜在TBST中洗涤，加入二抗室温孵育1 h，继续用TBST洗涤，将膜置于曝光仪曝光，使用Image-Lab软件分析各蛋白条带的灰度值，求各蛋白指标与内参β-actin的灰度值比，进行蛋白含量的差异比较。
1.5 统计学方法应用GraphPad Prism统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组数据比较采用单因素方差（One Way ANOVA）分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 细胞活性和LDH释放检测Control组细胞存活率为(98.09±1.07)%，与Control组比较，OGD组细胞存活率为(51.77±1.74)%，细胞活性明显下降，差异有统计学意义(t=22.62, P < 0.01)。与OGD组比较，OGD+ZNS组细胞存活率为(69.88±2.08)%，细胞活性明显增加，差异有统计学意义(t=6.67, P < 0.01)，见图 1A。
|
| A：细胞存活率检测图；B: 细胞LDH释放率检测图；n=5，与Control组比较，a P < 0.01；与OGD组比较，b P < 0.01；OGD为糖氧剥夺，ZNS为唑尼沙胺 图 1 各组细胞存活率及细胞LDH释放率的变化 Fig 1 The changes of cell activity and LDH release in each group |
|
|
Control组细胞LDH释放率为(15.13±0.83)%，细胞无明显凋亡坏死。与Control组比较，OGD组细胞LDH释放率为(47.94±1.58)%，细胞LDH释放率明显增加，细胞凋亡坏死明显增加，差异有统计学意义(t=18.29, P < 0.01)。与OGD组比较，OGD+ZNS组细胞LDH释放率为(33.43±1.28)%，细胞LDH释放率明显下降，细胞凋亡坏死明显减少，差异有统计学意义(t=7.10, P < 0.01)，见图 1B。
2.2 β-半乳糖苷酶细胞衰老染色β-半乳糖苷酶试剂盒可将衰老细胞染成深蓝色。细胞染色后显示，Control组细胞结构完整，体积正常，染色较浅，无明显衰老。与Control组比较，OGD组细胞结构明显破坏严重，体积明显增大，染色明显加深，细胞明显衰老。与OGD组比较，OGD+ZNS组细胞结构破坏明显减轻，体积明显缩小，染色明显变浅，细胞衰老明显减轻。见图 2。
|
| OGD为糖氧剥夺，ZNS为唑尼沙胺 图 2 各组β-半乳糖苷酶细胞衰老染色的变化(×200) Fig 2 The changes of β-galactosidase cell senescence staining in each group (original magnification×200) |
|
|
Mito Tracker Red荧光探针可将线粒体染成红色，DAPI可对细胞核染成蓝色。线粒体染色后显示，Control组线粒体为高度连接的线性结构组成，线粒体活性正常。与Control组比较，OGD组细胞线粒体结构变成点状，线性结构明显减少，线粒体活性明显下降。与OGD组比较，OGD+ZNS组线性结构明显增加，线粒体活性明显上升。见图 3。
|
| DAPI可对细胞核染色，呈蓝色；OGD为糖氧剥夺，ZNS为唑尼沙胺 图 3 各组Mito Tracker Red线粒体染色的变化(×1 800) Fig 3 The changes of Mito Tracker Red mitochondria staining in each group (original magnification×1 800) |
|
|
JC-1线粒体膜电位试剂盒可对线粒体进行染色，在线粒体膜电位较高时，形成聚合物（J-aggregates），可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，形成JC-1为单体（monomer），可以产生绿色荧光。线粒体染色后显示，Control组线粒体染色呈明显的红色，线粒体膜电位正常。与Control组比较，OGD组细胞线粒体染色红色荧光明显减弱，绿色荧光明显增强，线粒体膜电位明显下降。与OGD组比较，OGD+ZNS组线性染色红色荧光明显增强，绿色荧光明显减弱，线粒体膜电位明显上升，见图 4A。
|
| A: JC-1线粒体染色；B: 细胞ATP检测。n=5；与Control组比较，aP < 0.01；与OGD组比较，bP < 0.01；J-Aggregates为JC-1聚合物，Monomers为JC-1单体，OGD为糖氧剥夺，ZNS为唑尼沙胺 图 4 各组线粒体膜电位及ATP浓度的变化（×200） Fig 4 The changes of mitochondrial membrane potential and ATP concentration in each group (original magnification×200) |
|
|
Control组ATP浓度为（1.34±0.04）μM/μL，线粒体功能正常。与Control组比较，OGD组ATP浓度为（0.63±0.03）μM/μL，ATP浓度明显下降，线粒体功能明显受损，差异有统计学意义（t=11.33, P < 0.01）。与OGD组比较，OGD+ZNS组ATP浓度为（0.95±0.04）μM/μL，ATP浓度明显上升，线粒体功能受损明显减少，差异有统计学意义（t=5.48, P < 0.01）。见图 4B。
2.5 Western blot检测Control组各指标表达水平分别为：GRP78（1.01±0.02）、CHOP（0.79±0.04）、PDI（1.06±0.08）。与Control组比较，OGD组各指标表达水平分别为：GRP78（2.42±0.04）、CHOP（1.39±0.07）、PDI（2.16±0.06），均明显增加（t=28.17，6.58，10.54，均P < 0.05）。与OGD组比较，OGD+ZNS组各指标表达水平分别为：GRP78（1.71±0.02）、CHOP（0.91±0.06）、PDI（1.58±0.10），均明显下降（t=13.64，4.62，4.71，均P < 0.05）。见图 5。
|
| A：内质网应激相关指标表达水平变化；B~D：n=5；与Control组比较，a P均 < 0.05；与OGD组比较，b P均 < 0.05；GRP78为葡萄糖调节蛋白78，CHOP为增强子结合蛋白同源蛋白，PDI为蛋白二硫键异构酶，β-actin为β-肌动蛋白，OGD为糖氧剥夺，ZNS为唑尼沙胺 图 5 各组细胞GRP78、CHOP与PDI蛋白表达水平的变化 Fig 5 The changes of GRP78, CHOP, and PDI expression in each group |
|
|
TBI常因运动损伤、交通事故和其他外伤造成，是目前社会残疾和经济损失的主要原因之一[14-15]。TBI在初始损伤的基础上常伴随继发性脑损伤，主要包括内质网应激、氧化应激、炎症、细胞凋亡和线粒体损伤等，对神经功能造成严重影响，导致身体残疾和认知障碍。随着手术治疗和重症监护的进步，TBI的预后较前改善，但TBI的药物治疗仍相对较少，因此，迫切需要有效的药物，治疗TBI后脑损伤，改善患者生存预后。ZNS是一种抗癫痫药物，其神经保护作用在部分疾病模型中已得到证实：ZNS可通过脑源性神经营养因子信号传导减少黑质纹状体多巴胺能细胞受损，对神经退行性疾病模型具有治疗作用[16]；ZNS可以通过抑制内质网应激减少帕金森模型神经细胞凋亡[10]；ZNS可促进周围神经损伤模型中运动神经元神经轴突的伸长及外周神经再生[17]。然而，对于ZNS在TBI模型中神经保护作用的研究较少。因此，笔者建立OGD模型模拟TBI后神经细胞受损，并预给予ZNS，观察检测细胞存活、LDH释放及细胞衰老情况，结果显示，OGD后SH-SY5Y细胞存活率较Control组明显下降，LDH释放率明显增加，细胞受损严重，细胞明显衰老。而相比较OGD组，预给予ZNS的SH-SY5Y细胞存活率明显上升，LDH释放率明显减少，细胞受损衰老明显减轻。表明ZNS对OGD后的SH-SY5Y细胞活力及功能具有保护作用。
线粒体是细胞中制造能量的重要细胞器，线粒体受损可导致修复神经细胞的能量需求不足。线粒体膜电位下降和线粒体裂变与线粒体损伤有关，当线粒体膜电位降低时，能量需求不足，超极化可能会增加并导致细胞损伤[18]。裂变和融合的平衡与线粒体分布和动力学有关，平衡的改变会导致线粒体形态异常和神经元损伤[19]。抑制线粒体损伤可能是治疗TBI的有效措施。因此，笔者观察线粒体结构变化，检测线粒体膜电位、细胞ATP水平变化，结果显示，OGD后SH-SY5Y细胞的线粒体结构变成点状，线性连接结构明显减少，膜电位、ATP水平较Control组明显下降。而相比较OGD组，预给予ZNS的SH-SY5Y细胞线性连接结构明显增加，膜电位、ATP水平明显上升。表明ZNS对OGD后的线粒体具有保护作用，通过抑制线粒体受损可保护SH-SY5Y细胞功能。
内质网是负责靶向蛋白质和修饰的细胞器，其中含有新的膜蛋白和合成的分泌物。通常内质网是折叠过程的初始细胞器，当发生葡萄糖剥夺、氧化应激、病毒感染、缺氧和钙调节异常时，会诱发内质网应激和各种病理生理变化[20]。抑制内质网应激可能是避免OGD诱导的细胞死亡的重要方法[21]。因此，笔者测量与内质网应激相关蛋白：葡萄糖调节蛋白78（GRP78），增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP），蛋白二硫键异构酶（PDI）的表达水平变化，结果显示，OGD后GRP78、CHOP、PDI表达较Control组均明显上升。而相比较OGD组，预给予ZNS的SH-SY5Y细胞，GRP78、CHOP、PDI表达均明显下降。表明ZNS具有抑制OGD后内质网应激的作用，通过抑内质网应激可减少OGD后SH-SY5Y细胞受损。
综上所述，ZNS可以通过保护线粒体活性以及抑制内质网应激保护OGD后的SH-SY5Y细胞功能，减少细胞受损，ZNS对创伤性脑损伤糖氧剥夺细胞模型具有保护作用。然而，本研究目前仅停留在细胞水平，未进一步深入研究其他机制，对动物水平ZNS是否保护TBI后神经细胞功能也尚不清楚。下一步研究，笔者将同时建造TBI细胞及动物模型，研究ZNS是否通过其他机制对TBI糖氧剥夺细胞模型产生有益作用，以及是否在动物水平通过保护线粒体、抑制内质网应激等机制减少TBI后神经细胞受损，进一步为临床治疗TBI的方法及有效药物提供科学依据。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 滕陈怀：研究设计、实验操作、数据采集、统计学分析、论文撰写；吴芳芳、张开睿：实验操作、数据采集；张仁侃、徐绩、卢磊磊：实验操作，统计学分析；陈大庆：研究设计、论文修改
| [1] | Rubiano AM, Carney N, Chesnut R, et al. Global neurotrauma research challenges and opportunities[J]. Nature, 2015, 527(7578): S193-S197. DOI:10.1038/nature16035 |
| [2] | Hentig J, Campbell LJ, Cloghessy K, et al. Prophylactic activation of shh signaling attenuates TBI-induced seizures in zebrafish by modulating glutamate excitotoxicity through Eaat2a[J]. Biomedicines, 2021, 10(1): 32. DOI:10.3390/biomedicines10010032 |
| [3] | Han ZL, Chen FL, Ge XT, et al. MiR-21 alleviated apoptosis of cortical neurons through promoting PTEN-Akt signaling pathway in vitro after experimental traumatic brain injury[J]. Brain Res, 2014, 1582: 12-20. DOI:10.1016/j.brainres.2014.07.045 |
| [4] | Hsieh HL, Yang CM. Role of redox signaling in neuroinflammation and neurodegenerative diseases[J]. Biomed Res Int, 2013, 2013: 484613. DOI:10.1155/2013/484613 |
| [5] | Liang JM, Yu Y, Wang BY, et al. Ginsenoside Rb1 attenuates oxygen-glucose deprivation-induced apoptosis in SH-SY5Y cells via protection of mitochondria and inhibition of AIF and cytochrome c release[J]. Molecules, 2013, 18(10): 12777-12792. DOI:10.3390/molecules181012777 |
| [6] | Jordan J, de Groot PWJ, Galindo MF. Mitochondria: the headquarters in ischemia-induced neuronal death[J]. Cent Nerv Syst Agents Med Chem, 2011, 11(2): 98-106. DOI:10.2174/187152411796011358 |
| [7] | Deng CL, Yi RX, Fei MX, et al. Naringenin attenuates endoplasmic reticulum stress, reduces apoptosis, and improves functional recovery in experimental traumatic brain injury[J]. Brain Res, 2021, 1769: 147591. DOI:10.1016/j.brainres.2021.147591 |
| [8] | Murata M, Hasegawa K, Kanazawa I, et al. Zonisamide improves wearing-off in Parkinson's disease: a randomized, double-blind study[J]. Mov Disord, 2015, 30(10): 1343-1350. DOI:10.1002/mds.26286 |
| [9] | Tada S, Choudhury ME, Kubo M, et al. Zonisamide ameliorates microglial mitochondriopathy in parkinson's disease models[J]. Brain Sci, 2022, 12(2): 268. DOI:10.3390/brainsci12020268 |
| [10] | Tsujii S, Ishisaka M, Shimazawa M, et al. Zonisamide suppresses endoplasmic reticulum stress-induced neuronal cell damage in vitro and in vivo[J]. Eur J Pharmacol, 2015, 746: 301-307. DOI:10.1016/j.ejphar.2014.09.023 |
| [11] | Salvador E, Burek M, Förster CY. Stretch and/or oxygen glucose deprivation (OGD) in an in vitro traumatic brain injury (TBI) model induces calcium alteration and inflammatory cascade[J]. Front Cell Neurosci, 2015, 9: 323. DOI:10.3389/fncel.2015.00323 |
| [12] | Wu FF, Xu K, Liu L, et al. Vitamin B12 enhances nerve repair and improves functional recovery after traumatic brain injury by inhibiting ER stress-induced neuron injury[J]. Front Pharmacol, 2019, 10: 406. DOI:10.3389/fphar.2019.00406 |
| [13] | Condello S, Currò M, Ferlazzo N, et al. Protective effects of zonisamide against rotenone-induced neurotoxicity[J]. Neurochem Res, 2013, 38(12): 2631-2639. DOI:10.1007/s11064-013-1181-2 |
| [14] | Li JM, Feng ZC, Yeung FS, et al. Aldehyde dehydrogenase 1 activity in the developing human pancreas modulates retinoic acid signalling in mediating islet differentiation and survival[J]. Diabetologia, 2014, 57(4): 754-764. DOI:10.1007/s00125-013-3147-y |
| [15] | Pavlovic D, Pekic S, Stojanovic M, et al. Traumatic brain injury: neuropathological, neurocognitive and neurobehavioral sequelae[J]. Pituitary, 2019, 22(3): 270-282. DOI:10.1007/s11102-019-00957-9 |
| [16] | Sano H, Murata M, Nambu A. Zonisamide reduces nigrostriatal dopaminergic neurodegeneration in a mouse genetic model of Parkinson's disease[J]. J Neurochem, 2015, 134(2): 371-381. DOI:10.1111/jnc.13116 |
| [17] | Yagi H, Ohkawara B, Nakashima H, et al. Zonisamide enhances neurite elongation of primary motor neurons and facilitates peripheral nerve regeneration in vitro and in a mouse model[J]. PLoS One, 2015, 10(11): e0142786. DOI:10.1371/journal.pone.0142786 |
| [18] | Wolken GG, Arriaga EA. Simultaneous measurement of individual mitochondrial membrane potential and electrophoretic mobility by capillary electrophoresis[J]. Anal Chem, 2014, 86(9): 4217-4226. DOI:10.1021/ac403849x |
| [19] | Reddy PH. Inhibitors of mitochondrial fission as a therapeutic strategy for diseases with oxidative stress and mitochondrial dysfunction[J]. J Alzheimers Dis, 2014, 40(2): 245-256. DOI:10.3233/JAD-132060 |
| [20] | Rashid HO, Yadav RK, Kim HR, et al. ER stress: Autophagy induction, inhibition and selection[J]. Autophagy, 2015, 11(11): 1956-1977. DOI:10.1080/15548627.2015.1091141 |
| [21] | 叶嘉仪, 龚恒佩, 王凌峰, 等. 玄参环烯醚萜苷对氧糖剥夺再灌注细胞模型内质网钙稳态的调控作用[J]. 浙江大学学报(医学版), 2020, 49(6): 705-713. DOI:10.3785/j.issn.1008-9292.2020.12.05 |